(高清版)GB∕T 37966-2019 纳米技术 氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性测量方法

GB/T37966—2019纳米技术氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性测量方法国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会GB/T37966—2019 I Ⅱ 3术语和定义、缩略语 25仪器与试剂 2 3 48测量结果处理 6 6附录A(资料性附录)仪器准备 7附录B(资料性附录)氧化铁纳米颗粒铁元素质量浓度测量 附录C(资料性附录)氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性计算及不确定度评定实例 IGB/T37966—2019本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中国科学院提出。本标准由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归口。学院基础医学研究所、江苏省计量科学研究院、基蛋生物科技股份有限公司、南京医科大学第二附属医院检验医学中心。GB/T37966—2019氧化铁纳米颗粒由于丰富的磁学特性和良好的生物相容性而在生物医学等领域具有广泛的应用，性和类过氧化氢酶活性，这不仅拓展了磁性纳米材料的应用，也使模拟酶的研究从有机复合物拓展到无机纳米材料。目前，大量的基础研究和应用研究被报道，40多种纳米颗粒，包括四氧化三铁(Fe₃O₄)、γ-三氧化二铁(y-Fe₂O₃)、四氧化三钴(Co₃O₄)、氧化铜(Cu₂O)、锰铁氧体(MnFe₂O₄)、硫化铁(FeS)、氧化铈(CeO₂)、普鲁士蓝(PB)、金(Au)、铂(Pt)、石墨烯、富勒烯、碳纳米管等，被发现具有类过氧化物酶活性和其他模拟酶活性，其中尤以Fe、Co、Cu、Mn等具有变价的Fenton元素化合物纳米颗粒最为典型，并且在生物、医学、环境、农业等多个领域获得应用。纳米颗粒模拟酶相对于天然酶具有简单易得、稳定、成本低的优势，同时具有依赖于尺寸和表面可调的类酶活性，还兼具磁性、光学等其他多功能特性，因此更具研究意义和广泛的应用价值。纳米颗粒类过氧化物酶活性是指单位质量或体积样本中酶活性单位数。由于纳米颗粒类酶活性显前研究报道的纳米颗粒类酶活性数据难于比较，即使相同种类的纳米颗粒，其尺寸、表面等理化性质差异以及不同的测试条件都可能导致数据不具可比性。因此，建立一种纳米颗粒类酶活性测量和评价的标准方法至关重要。本标准为发展相关检测和医学诊疗试剂，以及环境、农业等领域中纳米材料类酶活性的评价提供了参考。1GB/T37966—2019纳米技术氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性测量方法1范围本标准规定了氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性的测量方法。本标准适用于采用分光光度计对氧化铁(如三氧化二铁、四氧化三铁等)纳米颗粒类过氧化物酶活性进行测量和评价。其他纳米颗粒的类过氧化物酶活性测量亦可参考。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T19267.2刑事技术微量物证的理化检测第2部分：紫外-可见吸收光谱法下列术语和定义适用于本文件。3.1.1三个维度的外部尺寸都在纳米尺度的纳米物体。[GB/T32269—2015,定义4.1]3.1.2酶活性enzymeactivity酶催化某一化学反应的能力。注1:酶活性大小可以用在一定条件下酶催化的某一化学反应的反应速率来表示。注2:在本标准中氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性是指单位Fe元素质量对应的氧化铁纳米颗粒所含酶活性单位注3:酶活性单位：国际生物化学协会酶学委员会推荐使用国际单位，即在规定条件下，每分钟催化一微摩尔(μmol)底物的酶量为一个国际单位(IU),简称U。1U=1μmol·min-¹。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。DMSO:二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide)H₂O₂:过氧化氢(Hydrogenperoxide)NPs:纳米颗粒(Nanoparticles)SOP:标准操作方法(StandardOperationProcedure)2GB/T37966—20194原理如图1所示，采用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为测量底物，在37℃和酸性条件(pH=3.6)下经氧化铁纳米颗粒的催化，TMB被H₂O₂氧化为蓝色的TMB衍生物，该衍生物在650nm波长下有特征吸收峰。在37℃、650nm波长下检测反应溶液吸光度随时间的变化，并根据朗伯比尔定律计算出单位时间内TMB衍生物的生成量，从而得到氧化铁纳米颗粒所含酶活性单位数(bmmo)。将bmmo除以加入的氧化铁纳米颗粒的铁元素质量，得到单位铁元素质量的氧化铁纳米颗粒所含酶活性单位数(amam),即氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性。吸光度吸光度一一AA/AAA/A0时间/sTM3十H₂O₂5仪器与试剂5.1仪器与器具器等。仪器准备参见附录A。仪器测试波长范围应包括650nm,具有“动力学模式”。吸光度准确度±0.005,波长准确度(650±1)nm,光谱带宽≤2nm。仪器校正及实验条件的设定应符合GB/T19267.2的规定。用来测量样品溶液温度，误差±1.5%,灵敏度±0.1℃。用来测量样品溶液pH,准确度等级为0.01级，灵敏度±0.01。5.1.5恒温水浴箱与分光光度计连接，控制比色皿槽恒温为(37±1)℃。用来称量试剂质量，最小分度值0.01mg,重复性(校验砝码)≤0.015mg(5g)。3GB/T37966—2019200μL、1000μL可调移液器。10mL、100mL容量瓶。5.2试剂所用试剂见表1。分类化学名称别名/缩略语试剂无水乙酸钠(分析纯)醋酸钠无水乙酸(分析纯)冰醋酸3,3',5,5'-四甲基联苯胺(分析纯)30%H₂O₂双氧水溶剂高纯度水电导率<2μS·cm-¹,pH6～7无二甲基亚砜DMSO标准物质铁单元素标准溶液(GBW08616)无邻苯二甲酸氢钾(GBW(E)130070)无混合磷酸盐(GBW(E)130071)无6溶液配制6.1一般要求配制溶液时各成分给出的质量是指100%含量。如果化学物质的含量低于100%[例如y(%)],则应用因子：Fcontent=100/y,计算出与给出质量相当的某化学物质的质量。溶液的配制要求应符合GB/T19267.2的规定。使用天平称量时，称量差异不应超过±0.5%。摩尔吸光系数具有显著的pH依赖性。因此，应严格校准pH计和调整缓冲液的pH值。使用至少两种标准缓冲液进行校准，校准缓冲液的定值包括的范围应包含或接近本标准中反应的pH值。称量醋酸钠0.164g,溶解于8mL水，转移至10mL容量瓶中，加水至容量瓶刻度得0.2mol·的醋酸钠溶液。4GB/T37966—2019将适量两种溶液混匀测pH,并用少量0.2mol·L-¹的冰醋酸溶液或0.2mol·L-¹的醋酸钠溶液调节pH至3.6(37℃),得0.2mol·L-¹,pH=3.6的冰醋酸/醋酸钠缓冲液。该溶液2℃~8℃保质期为3个月。6.3溶液2称量TMB0.10g溶于8mLDMSO中制成稳定的分散液，转移至10mL容量瓶中，加DMSO至容量瓶刻度得10g·L-¹TMB的DMSO溶液。该溶液2℃~8℃避光保存，保质期为1个月，宜分装保存。使用时应使其充分溶解，避免反复冻融，观察是否变色，并采用紫外可见分光光度计检验其吸收光谱是否发生变化。如果发生变化则严禁使用，并重新配制。6.4纳米颗粒分散液将待测的氧化铁纳米颗粒分散液用水稀释至适宜浓度。7测量步骤7.1测量条件具体测量条件见表2。参数指标温度检测波长光程孵育时间测量时间读点数7.2测量步骤7.2.2开启恒温水浴箱，监测比色皿内温度，达到37℃时开始准备试剂与待测液。7.2.3将适当体积的溶液1、氧化铁纳米颗粒分散液、溶液2和30%H₂O₂在恒温水浴中平衡到37℃。7.2.4将上述溶液按表3的体积和顺序加入到反应杯中。表3测量步骤体积步骤溶液1加入到反应杯中，并且平衡至37℃氧化铁纳米颗粒分散液加入到反应杯中，充分混合5GB/T37966—2019表3(续)体积步骤溶液2加入到反应杯中，充分混合，孵育60s。在孵育结束时，反应杯中的溶液温度应达到37℃加入到反应杯中，充分混合，转移适量反应液至比色皿中，测量规定时间内的吸光度(650nm)变化7.2.5具体测量流程见图2。达37℃达37℃加入0.100mL溶液2,充分混匀达37℃7.3试剂空白率测量试剂空白率测量1:用纯水代替30%H₂O₂溶液，测量方法同7.2。试剂空白率测量2:用纯水代替氧化铁纳米颗粒分散液，测量方法同7.2。注：宜重复3次，采用3次的平均值参与计算。7.4氧化铁纳米颗粒铁元素质量浓度测量参见附录B。6GB/T37966—20198测量结果处理8.1计算通过吸光度与时间的线性拟合得出吸光度随时间变化速率(min-¹)。扣除试剂空白率后，按式(1)计算氧化铁纳米颗粒所含酶活性单位数。………………式中：bnano--—氧化铁纳米颗粒所含酶活性单位数，单位为酶单位(IU或U);ε--——TMB衍生物的摩尔吸光系数，取值为39000mol-¹·L·cm-¹;l——比色皿光程，单位为厘米(cm);△A/△t———经空白率校正的反应液吸光度随时间变化速率，单位为每分(min-¹)。将bnamo除以加入的氧化铁纳米颗粒的铁元素质量，得单位铁元素质量的氧化铁纳米颗粒所含酶活性单位数。按式(2)计算氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性。式中：mFe-——氧化铁纳米颗粒所含铁元素质量，单位为毫克(mg)。8.2数据处理8.2.1必要时，每个实验室应建立适当的数据剔除规则。8.2.2计算多次测量值的均值、标准差，必要时应检查数据分布类型，计算均值的标准偏差。8.2.3必要时，评定测量不确定度。9报告测量报告应包含但不限于以下信息：b)样品信息：测量样品名称、数量等；c)测量依据(包括发布或出版年号);d)测量仪器；e)样品测量条件；f)测量结果；GB/T37966—2019(资料性附录)A.1分光光度计准备测量工作前，按已制定的SOP文件或JJG178规定的检定规程对分光光度计进行检查，填写表A.1。表A.1分光光度计准备准备事项具体内容开机前检查□温度□湿度□机身清洁□比色仓清洁□比色窗清洁组合恒温装置：□与分光光度计连接完整□提前开机测温装置：□电量口测温探头勿挤压、碰撞坚硬物体比色皿：口完整□清洁度口光程□比色皿间匹配开机注意事项光源灯：□提前预热仪器性能检查□核实是否在国家计量机构检定合格有效期内□仪器的自检是否正常预防性维护分光光度计：□无明显振动□及时待机□无线电干扰□UPS□使用后清洁温度计探头各实验室可根据具体情况制定本实验室分光光度计的准备流程。A.2温度计准备测量工作前，按已制定的SOP文件对温度计进行检查，填写表A.2。表A.2温度计准备准备事项具体内容开机前检查□电源□机身清洁口温度计温度探头是否正常组合□主机与温度计温度探头连接完整开机注意事项电量：□查看剩余电量校准提示：□查看校准有效期是否到期仪器性能检查□核实是否在国家计量机构检定合格有效期内大型实验前性能检查：□用计量合格的标准温度计检查温度的准确性预防性维护主机：□机身清洁温度探头：□使用后及时清洁78GB/T37966—2019各实验室可根据具体情况制定本实验室温度计的准备流程。A.3pH计准备测量工作前，按已制定的SOP文件对pH计进行检查，填写表A.3。表A.3pH计准备准备事项具体内容开机前检查□电源□接地□温度□湿度□机身清洁组合温度探头：□与pH计连接完整电极：口与pH计连接完整□内液的量□外液的量磁力搅拌器：□电源□接地□转速磁力搅拌子：□完整□清洁度□磁力pH标准溶液：□剩余量□有效期仪器性能保证每次应用前性能保证：更换电极内液和电极外液进行电极激活采用pH标准溶液进行校准预防性维护应用前：口更换电极内液和电极外液：电极激活应用后：□更换电极内液和电极外液：电极保养□清洁电极各实验室可根据具体情况制定本实验室pH计的准备流程。A.4恒温水浴箱准备测量工作前，按已制定的SOP文件对恒温水浴箱进行检查，填写表A.4。表A.4恒温水浴箱准备准备事项具体内容开机前检查组合□与分光光度计连接开机注意事项仪器性能检查□温度校正□温度稳定性预防性维护□定期更换进口水管□定期更换出口水管□清洗滤网□水箱内部消毒各实验室可根据具体情况制定本实验室恒温水浴箱的准备流程。A.5天平准备测量工作前，按已制定的SOP文件对天平进行检查，填写表A.5。9GB/T37966—2019准备事项具体内容开机前检查□电源口清洁□干燥剂颜色□水平珠位置开机自检□电量口零位显示校准□核实是否在国家计量机构检定合格有效期内大型实验前：□标准砝码校准每次应用前：□仪器自带校准预防性维护□定期进行保养口定期校准各实验室可根据具体情况制定本实验室天平的准备流程。A.6移液器准备测量工作前，按已制定的SOP文件对移液器进行检查，填写表A.6。表A.6移液器准备准备事项具体内容使用前检查□机身清洁□机械操作仪器性能检查□加样量正确性□加样量精密度预防性维护□定期进行保养□定期校准各实验室可根据具体情况制定本实验室移液器的准备流程。(资料性附录)氧化铁纳米颗粒铁元素质量浓度测量氧化铁纳米颗粒铁元素质量浓度测量采用紫外分光光度法。适当盐酸的酸化，盐酸羟胺的还原，以及邻二氮菲显色后，将溶液pH调至5左右，定容到50mL,用紫外可见分光光度计测量其在510nm处的吸光度。将吸光度数据同对应的Fe质量浓度进行线性拟合得C-A直线方程，见式(B.1):A=0.19956C+0.06171…………(B.1)式中：A——溶液在510nm处的吸光度。取待测溶液100μL,经过与对Fe溶液标准样品同样的处理方法显色后，定容到50mL,之后对其进行五次吸光度的测量，根据以上方程分别计算出质量浓度，取平均值后折算出100μL待测溶液的铁元素质量浓度。注：推荐使用质量可靠的铁单元素标准溶液，商品化的可溯源至国家或国际的铁标准样品已有出售。GB/T37966—2019(资料性附录)氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性计算及不确定度评定实例C.1氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性计算实验所用氧化铁(Y-Fe₂O₃)纳米颗粒浓度为0.046mg·mL-¹,重复测量次数n=3,去除试剂空白率后得到TMB衍生物吸光度随时间的变化图，见图C.1。吸光度0,900.85吸光度0.700.650.600.55-0.90-0.85-0.800.75-0.65-0.600.55-0.950.900.800.75-0.70-0.65-0.60-0.55-时间/min时间/min时间/min图C.1TMB衍生物吸光度随时间变化图(三次重复测量)对其进行线性拟合，得到直线斜率，见表C.1。表C.1测量结果汇总组号第一次测量第二次测量第三次测量△A/△t(min-¹)0.15730.15870.1589标准偏差6.31×10-41.51×10-31.23×10-3将以上三次测量得到的斜率、mFe=CFe×VFe=0.046mg·mL-¹×0.1mL=4.6×10-³mg、V=2400μL、l=1.000cm、E=39000mol-¹·L·cm-¹带入式(C.1)和(C.2):…………(C.1)anano=bnano/mFe…………(C.2)得到的计算结果见表C.2:表C.2anno计算结果组号第一次测量第二次测量第三次测量平均值标准偏差(单位：U·mg-¹)C.2不确定度评定C.2.1标准不确定度A类评定按照本标准规定的测量方法，对Y-Fe₂O₃纳米颗粒类过氧化物酶活性进行多次测量，经计算得到GB/T37966—2019anano,见表C.3。组号ann(单位为U·mg-1)第一次测量第二次测量第三次测量第四次测量Day1I2.1332.1012.3542.0902.0612.215Ⅲ2.3332.0212.101Day2V2.021V2.077Day3VI2.0982.1172.119V2.2132.0312.1332.0982.063注：表中“—”为用格拉布斯准则剔除掉异常值。根据实验标准偏差计算式(C.4),得S(a;)为0.142U·mg-¹。类标准不确定度为0.024U·mg-¹。…………(C.3)…………(C.4)…………(C.5)C.2.2标准不确定度B类评定C.2.2.1B类不确定度根据ammo的计算式(C.1)和式(C.2)类不确定度分量来源有：e、1、V、△A/△t、mFe。其中，TMB衍生物的摩尔吸光系数∈为常量，不产生不确定度。故B类不确定度的计算式(C.6)如下：下面对各不确定分量进行逐一分析。(C.6)C.2.2.2比色皿光程l比色皿由计量机构出具校准证书，并给出不确定度及扩展系数：l=1.000cm,U=0.003cm,k=2。由式(C.7)计算，得l的相对不确定度为0.0015。C.2.2.3反应杯内溶液总体积V该项不确定度来源于移液器。由于氧化铁纳米颗粒分散液、溶液2、30%H₂O₂的加样体积分别为100μL、100μL、200μL,远小于溶液1的加样体积(2000μL),故它们产生的不确定度可忽略不计。所以V的不确定度主要来自于可调量程移液器(量程100μL～1000μL),该值由移液器生产公司提供。由式(C.8)计算V的相对不确定度为0.002。C.2.2.4经过空白率校正的反应液吸光度随时间变化率△A/△t时间产生的不确定度可忽略不计。分光光度计由计量机构出具校准证书，并给出吸光度的不确定度及扩展系数：U=0.008,k=2。故Uc(A)=0.004。经分析，△A/△t的不确定来源有：分光光度计测量吸光度引入的不确定度、线性拟合引入的不确定度。将本例中具体数值带入，得反应溶液吸光度随时间变化速率的计算式(C.9)为：因此，分光光度计测量吸光度引入的标准不确定度的计算式(C.10)为：线性拟合直线斜率标准偏差的计算见式(C.11):式中：b——线性拟合直线的斜率；r——线性拟合的相关系数。经计算S,过小，可忽略不计。故△A/△t的相对不确定度可由式(C.12)表示：C.2.2.5氧化铁纳米颗粒所含铁元素质量mFe根据式(C.13)mFe=VFe×CFe…………(C.13)可得mFe的不确定度计算式(C.14)为：其中，VFe的不确定度来源于移液器，故：GB/T37966—2019CFe的不确定度来源于稀释过程。根据式(C.15)可得CFe的不确定度计算式(C.16)为：…………(C.15)C₀(Fe)为氧化铁纳米颗粒分散液(原溶液)的铁元素质量浓度。该质量浓度的测量方法参见附录B,测量结果为3.845mg/mL。将C。(Fe)溯源至国家铁单元素标准溶液，经分析，Uc[C₀(Fe)]=0.010mg/mL;V₀(Fe)的不确定度来源于1000μL移液器，Uc[V₀(Fe)]=2μL;V总的不确定度来源于50mL容量瓶。该容量瓶由计量机构出具校准证书，并给出不确定度及扩将上述数据带入式(C.14),可得：综上所述，在B类不确定度的计算式(C.6)中：由于△A/△t≈0.15远远大于其他所有分量引入的不确定度。根据不确定度计算中的三分之一微小不确定度原则，可代表整体的相对不确定度。故B类不确定度为：C.2.3扩展不确定度根据不确定度传