(高清版)GB∕T 38261-2019 纳米技术 生物样品中银含量测量 电感耦合等离子体质谱法

纳米技术生物样品中银含量测量电感耦合等离子体质谱法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I Ⅲ 1 1 1 1 1 1 2 3 410准确度和精密度 4 5附录A(资料性附录)实验流程图 6附录B(资料性附录)测试报告模板 8附录C(资料性附录)含有银包金纳米棒的生物组织中银含量的测量示例 9 ⅢGB/T38261—2019本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中国科学院提出。本标准由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归口。品监督管理局医疗器械技术审评中心。银纳米颗粒具有广谱的抗菌活性，广泛应用于生活用品以及医疗器械中1.2]。随着应用范围的不断扩大，银纳米颗粒进入人体的途径更加多样化，并以多种形式存在于生物组织中。因此，银暴露的风险引起了高度关注。在银纳米颗粒的毒代动力学等生物效应和安全性评价中，银纳米颗粒暴露后，可以以颗粒、离子等多种形式存在于生物样品中，而不同形式的银元素均在其生物学功能中发挥重要作用，所以准确测量生物样品中银元素的总含量非常重要。但是，目前尚无相关国家标准。电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)是以等离子体为离子源的一种质谱型元素分析方法，主要用于进行多种元素的同时测定，适用于痕量或微量重金属元素的分析13~5]。本标准包括经银纳米颗粒暴露的生物样品的微波消解方法，以及使用ICP-MS测量消解后样品中银元素总含量的方法。1GB/T38261—2019纳米技术生物样品中银含量测量电感耦合等离子体质谱法警示——本标准方法中使用的部分试剂具有腐蚀性和强氧化性，需谨慎防护，避免接触皮肤和衣1范围本标准规定了生物样品中银含量的定量测量方法，包括样品制备和测量步骤。本标准适用于多种生物样品(生物组织、细胞、3D组织模型等)中银含量的定量测量。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19619纳米材料术语GB/T30903无机化工产品杂质元素的测定电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)3术语和定义GB/T19619和GB/T30903界定的术语和定义适用于本文件。4缩略语下列缩略语适用于本文件。ICP-MS:电感耦合等离子体质谱(inductivelycoupledplasmamassspectrometry)5原理生物样品经微波消解后定容，所得溶液采用ICP-MS方法进行元素含量检测。定量方法采用内标法，即在待测样品、空白样品和加标样品中通过蠕动泵在线加入相同浓度的内标元素，根据银元素的强度与内标元素强度值的比值和银元素浓度的定量关系实现对银的定量分析。该方法中设置加标样品以判定测量结果的准确性。6仪器与试剂6.1.1电感耦合等离子体质谱分析仪(ICP-MS分析仪)。6.1.2微波消解仪：具备程式化功率设定功能，最大输出功率≥1200W,最高设定温度≥195℃。26.1.5赶酸仪：工作温度范围为室温至200℃。6.2试剂除非另有说明，分析时均使用确认为优级纯或以上级别的化学试剂，实验用水为符合GB/T6682规定的一级水，标准溶液使用有证标准物质。6.2.2银标准溶液：介质1.0mol/L硝酸。6.2.3内标标准溶液：介质1.0mol/L硝酸。宜选用铟(1¹⁵In)和铑(10³Rh)为内标元素，内标元素的选择原则参考GB/T30903。6.2.4氩气：纯度≥99.99%。7样品7.1样品前处理流程图参见附录A中图A.1。7.2待测生物样品制备7.2.1将冷冻的待测生物样品室温解冻，差量法准确称取一定量的样品(mr,宜为0.100g～0.500g)至55mL微波消解罐中。新鲜获得的样品可直接称量。注1:对于总质量不足0.100g的生物样品，可以实际称量质量为准。注2:体外3D模型生物样品直接将收集的样品投入消解罐即可，可不称量；体外2D细胞经胰酶消化、离心收集入7.2.2在上述每个微波消解罐中加入10mL浓硝酸，预消解30min。7.2.3旋紧消解罐，将其对称安装在转盘上进行微波消解。微波消解参考程序见表1。注：不同微波消解仪可根据仪器固有条件适当调整功率和消解时间等程序参数，保证样品消解完全即可。表1生物样品微波消解参考程序1步骤升温时间/min温度/℃保持时间/minl82285387.2.4待消解程序结束，取出消解罐冷却至室温。7.2.5旋开消解罐，使消解过程产生的气体缓慢释放，观察并确定样品是否完全消解。若消解完全，则执行步骤7.2.6。若消解液中仍有油脂小液滴，则参考表2中的程序继续消解，直至消解完全。GB/T38261—2019表2生物样品微波消解参考程序2步骤升温时间/min温度/℃保持时间/min18227.2.6将消解液在赶酸仪上加热赶酸至近干，宜在160℃加热约90min,取出消解罐冷却至室温。7.2.7将7.2.6中的消解液转移至已称量的15mL聚四氟乙烯管中，然后用体积分数为1%的稀硝酸洗涤消解罐2次～3次，将全部洗涤液转移至上述聚四氟乙烯管，并称量定容至10.000g～15.000g(m₁)用于银含量测量。7.2.8移取7.2.7中的消解液各1mL至离心管，室温差量法精确称量并记录该1mL溶液的质量(m₂,精确至1mg),用于数据分析。空白加标样品用来评价系统方法回收率。根据预实验生物样品中的银含量数据，确定在空白样品三组。对于肝脏以及其他含银纳米颗粒的特异性靶组织，适当提高加标样品组中银含量的设定值。将铟标准溶液用1%稀硝酸梯度稀释为内标标准工作溶液。若需配制储备液，则储备液于4℃密封保存，6个月内有效。由于不同仪器蠕动泵管内径不同，导致内标与样品溶液混合浓度不同，所以需根据内标元素在样品溶液中的终浓度配制内标工作液。内标元素在样品液中的质量浓度宜为将银标准溶液用1%稀硝酸溶液梯度稀释为至少五个浓度的系列银标准溶液。若需配制储备液，则储备液4℃密封避光存储，3个月内有效。一般情况下，系列浓度宜为1.00μg/L、2.00μg/L、5.00μg/L、10.0pg/L、20.0μg/L、50.0μg/L,可根据待测样品中实际银含量适当调整系列标准溶液的浓度范围。8试验步骤分析样品时，将7.4.1中的铟内标工作液由ICP-MS仪的内标管通过蠕动泵持续在线加入，以此来监控仪器信号漂移，并在一定程度上抑制基体效应。内标响应值应介于标准曲线响应值的70%~130%,否则说明仪器发生漂移或有干扰产生，应查找原因后重新分析。注：在线加入内标能够减少大批量样品检测的工作量，但是需避免在三通连接处有气泡时进行待测样品上样，以保证测定元素信号的稳定性。348.2绘制标准曲线将7.4.2中配制的标准银溶液由低到高浓度依次测量。以标准溶液浓度为横坐标，以银元素信号与内标信号的比值为纵坐标建立标准曲线。至少使用五个浓度的银标准溶液，且相关系数应≥0.99,否则应重复此步骤。8.3样品溶液测量分别将7.2.7和7.3中制备的样品依次测量。测定时在线加入与绘制标准曲线时相同量的内标溶液。全程序空白值应低于方法检出限或低于分析批样品最低测定值的10%。否则应重新分析，排除影响，直至符合要求之后才能分析样品。分析样品中银浓度若超出标准曲线范围，应用1%稀硝酸将样品稀释至标准曲线范围内重新测量。8.4测量流程图参见附录A中图A.2。9数据分析按式(1)计算生物样品中银的总质量m,单位为微克(μg):……(1)Pd——分析样品溶液测定质量浓度，单位为微克每升(μg/L);f———分析样品溶液的稀释倍数；m₁———分析样品消解液总质量，单位为克(g);m₂——分析样品1mL消解液质量，单位为克(g)。按式(2)计算单位质量生物样品中的银含量Xi,单位为微克每克(μg/g):mr——生物样品质量，单位为克(g)。10准确度和精密度10.1准确度同一分析批内，低、中、高空白加标样品批内准确度以回收率R计，均值一般应在空白加标样品标示值的±20%之内(低浓度可放宽至±25%)。银回收率R按式(3)计算：……m,——空白加标样品中回收的银的总质量，单位为微克(μg);mo——空白加标样品中加入的银的总质量，单位为微克(μg)。10.2精密度同一分析批内，低、中、高空白加标样品批内精密度以ε计，一般不得超过±20%(低浓度可放宽至5±25%)。银回收率的精密度∈按式(4)计算：式中：m₀——空白加标样品银的总质量平均值，单位为微克(μg)。11测试报告GB/T38261—2019本标准检测后出具的测试报告含有但不限于以下内容：a)待测样品信息：样品名称、样品编号、委托单位信息等；c)样品前处理方法：包括酸的类型，消解方法和条件等；d)电感耦合等离子体质谱仪测定条件；e)测试结果及其准确度或精密度值等；f)备注信息：包括与本标准规定的分析步骤的差异，在试验中观察到的异常现象等。报告模板参见附录B,测量示例参见附录C。6(资料性附录)实验流程图A.1样品前处理流程图样品前处理流程图见图A.1。否是符测图A.1样品前处理流程图A.2ICP-MS测量流程图ICP-MS测量流程图见图A.2。GB/T38261—2019全程序空白值需低于方法检出限或低于分析批样品最低测定值的10%1CP-MS开机在线内标校正测定条件优化在线内标校正测定条件优化稀释校正稀释校正标准曲线绘制否相关系数是否大于0.99?是空白加标样品溶液待测生物样品溶液生物样心消解液稀释生物样心消解液稀释至标曲范围内数据分析图A.2ICP-MS测量流程图78(资料性附录)测试报告模板测试报告参考模板见表B.1。表B.1测试报告样品名称送检日期样品编号完成日期委托单位样品状态样品数量样品规格检测项目及要求检测依据(方法)主要前处理设备及编号主要检测设备及其编号样品前处理方法测定条件测试结果备注(检测专用章)编制审核批准签发日期9GB/T38261—2019(资料性附录)含有银包金纳米棒的生物组织中银含量的测量示例C.1银标准溶液市售的银标准溶液，质量浓度为994mg/L±3mg/L。C.2仪器C.2.1微波消解仪。C.2.2赶酸仪。C.3样品制备按照7.2中的微波消解法充分消解肾脏组织。称取组织放入洁净的聚四氟乙烯消解罐中，加入10mL优级纯浓硝酸，预消解30min后旋紧盖子，对称安装在转盘上，按照表1中的程序进行微波消解。消解完成并冷却至室温后，在赶酸仪上160℃赶酸至近干。将冷却至室温的消解液转移至15mL聚四氟乙烯管中，并用1%硝酸重量法定容至10.000g～15.000g。适当稀释后，ICP-MS检测。C.3.2空白加标样品根据预估的大鼠肾内银含量，加标样品设置为空白消解罐中加入含银量为0.10μg、1.00μg、10.0μg的三组标准银溶液的样品，每组三个平行。经消解、检测后计算回收率。同时，以实验用水代替标准银溶液，制备全程序空白溶液。C.3.3铟内标溶液将1mg/mL的标准铟溶液梯度稀释至10mg/L。吸取该稀释液1.25mL至容量瓶中，以1%稀硝酸定容至500mL,配制成25.0μg/L铟标准溶液作为内标工作溶液备用。C.3.4系列银标准溶液将1mg/mL的银标准溶液分别逐级稀释到1mg/L备用。分别取上述1mg/L的银标准溶液用1%硝酸稀释到50mL,配制成1.00μg/L、2.00μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L的系列银标准溶液。C.4电感耦合等离子体质谱检测按照第8章测定各样品中银含量。主要检测条件见表C.1。GB/T38261—2019表C.1电感耦合等离子体质谱仪检测条件参数RF功率等离子体气流速辅助气流速载气流速溶液提升速率数值C.5结果C.5.1根据第9章进行银含量计算。C.5.2根据第10章分析准确度和精密度。C.5.3表C.2详细列出了电感耦合等离子体质谱检测含有银包金纳米棒的肾脏组织以及加标样品银含量的检测结果。结果显示，三组空白加标样品中，精密度均在(100±20)%之内；低浓度组银的回收率均在(100±25)%之内，中、高浓度组银的回收率均在(100±20)%之内。表明肾脏组织中的银含量结果具有较高的表C.2实验检测结果及其数据分析1.全程序空白样品样品名称Ag0-1Ag0-2Ag0-3样品消解液定容质量m₁/g分析样品1mL消解液质量m₂/g测量质量浓度pa/(μg/L)银质量m/μg<0.01<0.01<0.012.空白加标样品样品名称Ag0.1Ag1平行样品123123123样品消解液定容质量m₁/g分析样品1mL消解液质量m₂/g稀释倍数f1测量质量浓度pa/(μg/L)银质量m/μg0.090.090.080.920.898.769.06平均银质量m。/μg0.09±0.0050.95±0.089.5±1.0批内准确度R/%批内精确度∈/%78GB/T38261—2019表C.2(续)3.含有银包金纳米棒的肾脏组织样品名称样品质量mr/g样品消解液定容质量m₁/g1mL样品消解液质量m₂/g稀释倍数f测量质量浓度pa/(μg/L)银质量m/μg单位质量生物样品银含量X/(μg/g)测试报告参见表C.3。样品名称送检日期样品编号完成日期委托单位样品状态固态样品数量1样品规格—检测项目及要求ICP-MS检测大鼠肾脏组织银含量检测依据(方法)主要前处理设备及编号主要检测设备及其编号样品前处