抗体酶的研究概况与进展副本

《抗体酶的研究概况与进展》作者：7-2-抗体酶的研究概况与进展专业名称：年级：姓名：学号：指导老师：联系方式：完成日期：目录TOC\o"1-5"\h\z\u抗体酶的研究概况与进展 3摘要 30引言： 41抗体酶的研究思路与历史： 51.1抗体酶的研发思路： 51.2抗体酶的问世： 52抗体酶的基本性质和结构： 52.1抗体的结构： 52.2抗体酶的基本结构及性质： 63抗体酶催化反应的类型： 63.1酰基转移反应： 63.2水解反应： 63.2.1磷酸酯水解反应： 73.2.2酰胺水解反应： 73.3重排反应： 73.4光诱导反应： 73.5氧化还原反应： 73.6金属螯合反应： 83.7磺酸酯闭环反应： 84抗体酶的制备方法与筛选： 84.1抗体酶的制备原则： 84.2抗体酶的制备方法： 84.2.1单克隆抗体技术： 94.2.2拷贝法： 94.2.3直接引入天然或合成的催化基团： 94.2.4生物工程法： 104.2.5相似分子诱导法： 104.2.6共价抗原免疫法： 104.3抗体酶的筛选： 104.3.1ELISA法： 104.3.2酶学活性检测法： 104.3.3短过渡态类似物法： 114.3.4基因筛选法： 115抗体酶的应用： 115.1戒毒治疗： 115.2肿瘤治疗： 115.3抗艾滋病毒： 125.4甲状腺疾病治疗： 125.5在有机合成中的应用： 126展望： 13参考文献： 14抗体酶的研究概况和进展摘要抗体酶是具有催化活性的免疫球蛋白，又被称为催化抗体。它兼具抗体的高度选择性和酶的高效催化性，可催化多种化学反应，对多个学科都具有较高的理论和实用价值。用人工方法合成的抗体酶，可作为研究酶作用机理的有力工具，用于催化大量天然酶不能催化的立体专一性反应，更为开发具有高度选择性的药物指明了方向。本文拟就抗体酶的研究概况及进展作一综述。关键词：抗体酶；催化反应；人工合成AbstractAbzymeiscatalyticallyactiveimmunoglobulin,isalsonamedCatalyticantibody.Itcombinesantibodyhighspecificityandtheenzyme'scatalytic,cancatalyzeavarietyofreactionstomultipledisciplines,haveahighertheoreticalandpracticalvalue.Usingartificialsynthesismethodofabzyme,canbeusedasapowerfultooltostudyenzymemechanism,forcatalysisofnaturalenzymecannotcatalyticstereospecificreactions,moredevelopedahighlyselectivedrugstopointtocleardirection.Inthispaperwillsummarizetheresearchprogressofabzyme.Keyword：Abzyme；catalyticreaction；artificialsynthesis0引言：抗体酶，本质为免疫球蛋白，只是在易变区被赋予了酶的属性，故又称为催化抗体(Catalyticantibody)，是1986年底才出现的一种生物工程技术[1]。抗体酶已由催化简单的酯解反应，发展到具有包括酰胺水解、酰基转移、光诱导反应、氧化还原反应、金属螯合反应等多重催化功能，对多个学科都具有较高的理论和实用价值的一类新型蛋白质。抗体酶是一种新型人工酶制剂，它是依据对酶分子的催化反应机制的理解，结合免疫球蛋白的分子识别特性，应用免疫学、细胞生物学、化学和分子生物学等技术制备的具有高度底物专一性及特殊催化活力的新型催化抗体。抗体酶的多样性、特异性和稳定性，已形成了生物界中一个崭新的超分子体系，它把免疫学、酶学理论的发展和抗体在医药级工业等领域的应用推向一个新水平。本文拟对抗体酶的研究思路与历史、基本性质与结构、催化反应类型、制备方法与筛选及应用前景作一下介绍。

1抗体酶的研发思路与历史：1.1抗体酶的研发思路：1946年，Pauling[2]用过渡态理论(Transitionstatetheory)阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态或高能反应中间体(high-energyreactionintermediates)，从而降低反应能级，利于反应物分子跨越能垒，从而加速反应[3]。他指出，酶通过某种方式与高能、短寿命的过渡态结合而起催化作用。这个过渡态构型中某些键在形成，另一些键在断裂，存在时间极短，半衰期约为10-10~10-12s，实际中极难捕获。同时，Pauling又指出酶和抗体的根本不同在于前者选择性的结合一个化学反应的过渡态，而抗体则是结合一个基态分子。

受Pauling过渡态理论的启发,1969年，Jencks[4]提出猜想：以过渡态类似物作为抗原，则其诱发出的抗体即与该类似物有着互补的构象，这种抗体与底物结合后，即可诱导底物进入过渡态构象，从而引起催化作用。

1984年，Lerner进一步推测：以过渡态类似物作为半抗原，则其诱发出的抗体即与该类似物有着互补的构象，这种抗体与底物结合后，即可诱导底物进入过渡态构象，从而引起催化作用。使抗体兼具酶的活性,其意义之重大是不言而喻的,其难度之大也是可想而知的。初看起来,有了Pauling和Jencks的理论,具有酶的催化性质的抗体——催化抗体已呼之欲出了,但要把理论上的预言变为现实,往往有赖于技术上的重大突破,单克隆技术的成功使催化抗体的诞生成为水到渠成瓜熟蒂落的事情。1.2抗体酶的问世：根据这个猜想，1986年，Lerner和P/C.Schultz[5]所领导的小组分别独自证明了：针对羧酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体，能催化相应的羧酸酯和碳酸酯的水解反应。1986年12月，Lerner和P/C.Schultz小组同时在《Science》上报道：他们成功的得到了具有酶活性的抗体，并将这类具有催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体，标志着抗体酶的研究有了重大突破。此抗体酶成为科学界的“宠儿”。2抗体酶的基本性质与结构：2.1抗体的结构：抗体和酶一样是大分子蛋白质，由2条相同的轻链（约2500u）和2条相同的重链（约5000u）组成（图1）。轻链由VL（可变区）和CH（不变区）组成，重链也有VH（可变区）和CH（不变区）组成。重链和重链及重链和轻链间通过二硫键相连。此外，重链还有一连接枢纽。抗体的结合部位由6个超变区组成。对同类型抗体CL和CH部分氨基酸的序列相同，然而VL和VH是非常专一的。可变区约由100个氨基酸组成，至少可产生1亿个不同抗体，它是抗体多样性的基础。抗原结合片段(Fab)由轻链和重链VH级CHI组成。抗体-抗原复合物是借助范德华力、疏水作用、静电作用及氢键作用而形成。图1抗体2.2抗体酶的结构性质：抗体酶主要来自IgG抗体分子。对抗体结构分析表明，IgG分子s是由两条相同的重链及两条相同的轻链靠二硫键连接而成。木瓜蛋白酶作用抗体后，产生3个片断，其中相同的两个片断为抗原结合片断(Fab)；在抗原结合片断中与抗原结合的部位，是高度可变区(Fv)，该部位广泛的结构及顺序变化决定了抗体对外来物质的识别特性，其中电荷互补及立体互补是其分子识别的主要特征[6]。3抗体酶催化反应的类型：抗体酶可催化多种化学反应，包括酰基转移、酯水解、酰胺水解、重排反应、光诱导反应、氧化还原分应、金属螯合反应等[7]。3.1酰基转移反应：生物体内蛋白质合成是一个复杂的过程。氨基酸在掺入肽链之前必须进行活化以获得额外的能量，这一活化过程即是酰基转移反应。1986年，Tramonatano等研制成功首例酰基转移酶抗体。目前，该抗体酶的研制已接近实用阶段。Jacolson等设计了一个中性磷酸二酯作为反应过渡态的稳定类似物，得到的单克隆抗体可以催化带丙氨酰酯的胸腺嘧啶3’-OH基团的氨酰化反应，反应速度为5.4×104(mol/L-1.min)，比无催化反应的速度提高了108倍。这使新型tRNA的合成工作获得突破性进展。3.2水解反应：目前，抗体酶能够催化生物体内两类水解反应：酯水解和酰胺水解。3.2.1磷酸酯水解反应：磷酸酯键是自然界最稳定的键之一，它的水解是对抗体酶的挑战。Janda等利用稳定的五配位氧代铼络合物A模拟RNA水解时形成的环形氧代正膦中间物，产生了一种单抗G12，可以催化水解磷酸二酯键。它的催化速度常数(Kcat)=1.53×10-3s-1,米氏常数(Km)=240μmol/L。3.2.2酰胺水解反应：能蛋白质的水解均属于酰胺水解。B.L.Iverson等用CoⅢ—三乙烯酰胺—肽复合物作为半抗原，得到能特异性的切割Gly-Phe之间肽键的抗体酶。这意味着，随心所欲的切割肽段成为可能，蛋白质一级结构的测定将会变得十分简单。3.3重排反应：Claisen重排是有机化合物异构化的一种重要形式，生物体内一些化合物在光照下会发生Claisen重排。Jackson等研制的分支酸异构化抗体酶表现出高度的立体专一性，只能催化以(-)—分支酸为底物的反应，而对(+)—分支酸无作用,其活化熵接近于零。这一研究表明抗体可以诱导底物的构象，呈现有利于重排的状态。

Katherine等发现抗体酶1F7具有分支酸异构化催化活性，于是将该抗体的编码基因克隆，在缺乏分支酸异构酶的Saccharromycescerevisiae菌株中扩增表达，产生催化效率60%~70%的抗体酶。这一表达系统的成功研制使得运用基因工程手段对第一代抗体酶进行改造成为可能。3.4光诱导反应：光诱导反应包括光聚合反应和光裂解反应。这两类反应在植物体内显得尤为重要。DNA的修复也涉及到光诱导反应，Cochran对胸腺嘧啶二聚体光解进行研究，发现天然光复活酶的活性中心是色氨酸，由此找到相应的抗体酶IgG15F1—3B1，此抗体的转换数(T.N.)和光复活酶相近。Balan研究了光聚合反应的抗体酶，通过诱导法，得到的抗体酶催化效率虽不高，但也使反应速度提高了2.5倍。3.5氧化还原反应：氧化还原反应在生物体内十分广泛，主要是呼吸链的一系列反应。在溶液中，氧化态黄素与还原态黄素的电位差是206mV。Shokat认为可以根据氧化态和还原态在形状上的不同（氧化态为平面状，还原态为曲面状）构制能与氧化态结合的抗体，通过特异性结合，使氧化态稳定，从而使标准还原电位差扩大。据此设想，Shokat制得了对氧化态Km=8mmol/L，对还原态Km=300nmol/L的抗体，使标准电位差变为-342mV，由此，黄素还原态的还原范围相应扩大，一些原来无法按其还原的物质（即标准还原电位差大于抗体酶催化的黄素标准还原电位差）得以还原。这意味着抗体酶可以使热力学上原来无法进行的氧还反应得以进行。3.6金属螯合反应：金属螯合反应对于辅酶、辅因子和酶的结合来说意义重大。P.G.Schultz等用N-甲基卟啉诱导产生的抗体可以催化平面状卟啉的金属螯合反应，例如，它不仅可以催化Zn2+和卟啉的螯合，还可以催化Co2+、Mn2+和卟啉的螯合。如果以原卟啉Ⅸ或次卟啉Ⅸ作为底物则不表现催化活性，说明该抗体酶对其中某些金属卟啉具有很高的亲和力。由此，人们可以研制抗体—血红素复合物为催化剂催化氧化还原反应和电子传递反应。3.7磺酸酯闭环反应：Lerner等人用脒基离子化合物作为半抗原产生的抗体酶(17G8)可以催化磺酸酯化合物的闭环反应。4抗体酶的制备方法与筛选：酶与其催化的活性化合物间具有结构互补的性质，即酶分子与“反应过渡态”化合物互补，从分子识别角度看，这种互补关系类似于抗体抗原间的互补作用。4.1抗体酶的制备原则：实现抗体向酶转变的关键是抗原能诱导已具有酶活性的抗体。要使抗体具备催化活性即要使其具备酶的特征，为使抗体具有酶的结构，就必须在抗原的结构上进行改造。而抗体设计的原则就是酶的催化机制，故免疫学原理以及过渡态理论是抗体酶设计的主要依据[8]。酶－底物、抗体－抗原的结合模式是相近的，即均具有高亲和力和空间结构及电荷分布上的互补特性。但上述两种结合对象不同，由于抗体仅仅与低能结构结合，所以通常情况下抗体不具备催化活性。那么，若利用某一反应过渡态的模拟物作为抗原，则可得到催化该反应的抗体。且这一过渡态类似物具有稳定结构，这样就可以用化学手段加以合成。制备抗体酶的关键在于设计半抗原，只有这种特定的抗原才能诱导具有酶样结构与功能的抗体。4.2抗体酶的制备方法：目前，制备抗体酶较常用的经典方法就是单克隆抗体技术，最近发展了几种新的抗体酶制备方法[9]。4.2.1单克隆抗体技术：这种方法重点在于用来作半抗原的模拟物要满足制备需要而且要稳定，只有这样才能产生与过渡态高度亲和的抗体酶（图2）。图2单克隆抗体技术4.2.2拷贝法：拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的（图3）过程：首先,用已知的酶作为抗原免疫动物,通过单克隆技术,得到抗酶抗体。然后,再将此抗体作为抗原去免疫动物,再次采用单克隆技术,经筛选和纯化就可获得具有原来酶活性的抗体酶。缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。因为抗原与该抗原产生的抗体具有互补性,经两次拷贝,就把酶的活性部位的信息翻录到抗体酶上了,使该抗体酶活性中心的空间结构与原酶的形状完全一致,保证了对同底物的特异性。图3拷贝法4.2.3直接引入天然或合成的催化基团：化学诱变法：将合成或天然具有催化活性的基团通过化学修饰法引入到抗体分子中。抗体酶和酶都可以用化学修饰法加以改造,关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。游离巯基就是适合的基团之一,它具有高亲和性,易于氧化,能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。一般先用可裂解亲和试剂与抗体作用,然后再用二硫苏糖醇处理,则在抗体的结合部位附近引入巯基,用此巯基作为锚可以很方便地引入其它化学功能团,如咪唑基等。用此法已制备出了含有活性部位巯基和咪唑基的具有水解活力的抗体酶。此法不需要了解反应的过渡态及反应的详细机制,而且可以引入天然和人工合成的辅因子。4.2.4生物工程法：Scripps研究院的研究人员开创了一项革命性的技术——在体外制造抗体片断即Fab片断。Fab片断由轻链和重链的两部分组成。作为一种催化剂，抗体酶有这样的片断就行，无须完整的抗体分子。有了这种新技术，科学家们就无须在要得到一种新的抗体时，就要用抗原给老鼠注射一次，而是从人或动物的抗原中抽取基因，然后用酶反应复制基因的聚合酶链反应（PCR）技术重新铸造轻链和重链，这样就可以把这些基因组合成100万个含有成对轻链和重链的基因库。这些基因库是存储在细菌病毒里的。片断里的基因通过细菌的形式表达出来。这样就可在细菌培养中繁殖数百万计不同抗体，将它们用于催化反应比使用老鼠杂交细胞更快更方便。4.2.5相似分子诱导法：在反应过渡态类似物难以合成的条件下，采用化学结构相似的分子如酶的抑制剂分子做半抗原，也可筛选到抗体酶。免疫系统对一个半抗原可产生一些结构大致相同，但却存在细微差别的抗体，因此用含有与半抗原类似结构的化合物筛选单克隆抗体，也会找到所需要的有特殊识别功能及催化作用的抗体酶。4.2.6共价抗原免疫法：这是目前在亲和标记抑制剂基础上发展起来的新抗体酶制备方法。如果以亲和标记剂为半抗原，则抗体结合部位将产生与亲和基团电荷性质相反的基团，如：亲核性和亲电性氨基酸、酸性氨基酸及碱性氨基酸等。该途径适用于产生一些活性部位中含有上述氨基酸的酶。4.3抗体酶的筛选：在制备抗体后，抗体酶的筛选是很重要的。常见的筛选方法如下[10]。4.3.1ELISA法：用ELISA法筛选对半抗原有亲和力的单克隆抗体，然后大量培养，分析单克隆抗体的酶学活性。4.3.2酶学活性检测法法：直接用反应底物检测细胞培养液中抗体的酶活性。此法比ELISA法更简单，但需要抗体具有可观测的酶活力。4.3.3短过渡态类似物法：以过渡态类似物中含有的必需基团的基本结构单元作为筛选单克隆抗体的标准。这是一种快速鉴定与过渡态结合抗体的方法，这样对该化合物亲和力越强的化合物，其催化效率越高。4.3.4基因筛选法：应用基因探针，对基因抗体库进行分析和筛选。5抗体酶应用前景：5.1戒毒治疗：Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性要高于血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的。5.2肿瘤治疗：目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗(ADEPT)技术。ADEPT是将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体(如癌胚抗原抗体)相偶联制备成肿瘤细胞特异性的抗体酶,这种抗体可以只是其Fab片段，以增加分子的穿透性，并降低其自身药物的免疫原性。催化前药分解的酶通过抗体的介导作用而结合于肿瘤细胞的表面。静脉注射前药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力，到提高肿瘤化疗效果的目的(图4)[11]。图4ADEPT杀癌细胞机制5.3抗艾滋病毒：HIV通过其核衣壳蛋白gpl20与T淋巴细胞CD4分子结合而侵染Th细胞，摧毁人体免疫系统破坏免疫防御功能,患者并发症或肿瘤而死亡。SudhirPaul研究小组利用蛋白质工程方法制作出抗体酶，它能水解HIV的gpl20上编号为421-433的一小段肽序列。研究证明该序列具有高度的保守性，因而这种酶能辨识世界各地发现的几乎所有的HIV毒株，从而解决了HIV的多变性问题。目前，研究人员正研究将该抗体酶输入血液来开发HIV免疫疗法。这种抗体酶也能用作阴道或直肠局部用剂配方来防范经性传播而引起的HIV感染。5.4甲状腺疾病治疗：甲状腺激素是维持正常代谢和生长发育所必需的激素。含两种含碘氨基酸:T3(三碘甲状腺原氨酸)和T4(四碘甲状腺原氨酸)，T4脱碘转化为T3后具有生物学活性,反应由含硒的碘甲状腺原氨酸脱碘酶催化,缺乏该酶可导致体内T3含量不足,引起严重的甲状腺疾病[12]。利用抗体酶技术模拟脱碘酶活性,有望治疗因缺乏该酶导致的甲状腺疾病。Lian等以T4为半抗原合成了抗体酶Se-4C5,该酶具有很高的脱碘酶活性,对治疗甲状腺疾病有很高的应用价值,其作用机制为二底物乒乓机制。5.5在有机合成中的应用：复杂天然产物的合成一直是有机合成中的热点之一。Sinha等第一次把抗体酶用于天然产物(-)2a2Multistriatin的合成(图5)。(-)2a2Multistriatin含有四个不对称中心(1S2R4R5S)，催化抗体14D9能对映选择性地水解烯醇醚15生成含有绝对构型(S)的酮16，取得合成成功关键性的第一步。所有四个不对称中心都来源