中医证的动物模型研究思路

中医“证”的动物模型第一节中医证的动物模型研究思路中医证候动物模型是现代中医学研究的基础，是中医动物实验的核心。中医证的动物模型是中药新药有效性评价的工具，可为中药新药研制和开发、中药药理研究提供坚实的实验基础.中医学术发展缓慢的一个重要原因就是实验研究体系不够完善，缺少自己的科学规范、指标体系和方法论。中医证候动物模型的建立可弥补上述缺陷，有利于促进中医药学的现代化。理想动物证候模型制备原则1.症状、病理变化与临床证型相似。临床同一证型可能有多种不同的病理状态；同一证的模型也可有多种原因造成。模型不仅要与证对应，而且要尽可能与特定的病理对应，病因相似。理想动物证候模型制备原则2.代表方药治疗后可纠正上述证候、病理生理变化。治疗效果作为反证以衡量模型是否成功。3.检测指标具有客观性、敏感性、重现性，可定量或半定量。迄今制备“证”的模型主要采用的方法：1.按病因、病机理论建立模型：

某些病因、病原可以引起类似于中医某种证的病理生理变化。例如由某些致病菌，毒素引起的疾病，发展到某一阶段都会出现中医描述的“热毒”证。包括面赤身热，口渴便秘或泄泻，小便短赤，舌红苔黄，烦躁不安，甚至神昏谵语等。因此可通过向动物体内注射致病菌，如伤寒，副伤寒，甲，乙三联菌苗，或注射细菌内毒素如大肠杆菌内毒素，伤寒杆菌内毒素等造模。清热解毒药对这一方法产生的病理模型变化具有改善作用。以此方法制备的“热症”模型，可用于评价清热解毒新药的解热作用。再如慢性泄泻可致脾虚，用大黄等给动物长期服用可制备脾虚模型。健脾温中方药可缓解此脾虚证。2.以病拟证：有些疾病发展到某一阶段，某种证的表现比较明显。◆如甲亢患者常见阴虚火旺，五心烦躁，颧红，消瘦等阴虚症状，故可用甲状腺激素制备阴虚模型。中药生地，玄参，麦冬，龟板等给予此模型动物，可改善症状。◆另一方面也可用他巴唑制造阳虚模型。◆贫血患者常表现有血虚，所以用少量多次放血，或用化学药物损伤动物的骨髓造血功能，制备动物模型，能够造成动物疲倦少动，消瘦乏力等与血虚相关的一些表现，以及血液红细胞数下降等与临床血虚病人相似的生理生化变化。用当归补血汤后可改变这些病理生理变化。3.直接模拟证的病理变化：如对证的某些病理变化已有所了解，可直接用药理、化学或物理方法制造这一变化，以形成与该证接近的病理模型。如血瘀证，目前一般认为它主要表现为循环障碍和血液流变学障碍。因此常用一些方法，人为制造微血流淤滞，血液粘度增高，使微循环的血流不畅。病证结合模型研究思路1.同病不同证。如不同方法造成的消化性溃疡病模型对不同的辨证施治方药反应不同，认为其属于不同的证候。又如用肾动脉狭窄法形成的高血压模型属肾阴虚型；高肾上腺皮质激素制备的高血压模型属于肾阳虚型。2.由病致证。如感染性休克在其演变过程中分别发生了热厥证、热厥气脱证、元气外脱证。3.病与证分别发生，但有时间上的同步性。如在建立脾虚模型基础上对动物接种肿瘤细胞株而形成脾虚型肿瘤模型。病证结合模型模拟临床辨证、辨病相结合的情况，是在同一动物体上同时复制具有相互联系的现代医学的病及中医证候，其实质是一类中西医结合模型。病证结合模型增加了模型的变量，使研究的复杂性及提供的信息量均大幅度增长。现有动物证候模型的缺陷1.模拟的病变与真实疾病病理变化存在差异。2.与人类疾病及证候的临床表现不完全相同。3.同一病的证候分型，缺少客观化、可量化检测指标。4.部分模型缺乏稳定性，病理、症状变化可自行缓解。应用注意比较成熟、科学合理的中医证(病)动物模型甚少。大部分尚处于探索阶段。对一个药物的药效需要用几个模型从不同侧面验证。切忌单凭个别动物实验指标的测定结果就作绝对的肯定或否定。

第二节现有几种证的动物模型研究简介一、阴虚证造模材料：成年大鼠，200～250g；小鼠，7～8周龄，左旋甲状腺素钠或甲状腺素。造模方法：成年大鼠以甲状腺素1-10mg／kg灌胃，连续3周；或小鼠以L－甲状腺素钠1-20mg／kg皮下注射，连续4～5d。原理：甲状腺功能亢进主要表现为肾阴虚证，通过给实验动物大剂量使用甲状腺素，复制出甲状腺功能亢进性肾阴虚证动物模型。呈现肝、肾组织耗氧量增加等。

阴虚证造模后的指标变化：动物出现体重减轻，体温升高，心率加速，躁动不安，饮水量、耗氧量增加，痛阈下降。肝脾核酸合成增加，外周微循环血管开放数目增加，血流加速，心肌、肾脏和脑组织β受体数量均增加；红细胞、肝、肾组织的Na+，K+-ATP酶活性增高。

益气养阴泻火药对甲亢动物的影响操作方法：取体重18～28g小鼠，每天以三碘甲状腺氨酸(T3)，1mg／kg灌胃，连续3～5天。益气养阴泻火药复方，制成2g/ml煎剂，于造型同时给予0.6ml／只灌胃。结果，甲亢组肝组织耗氧量较正常组增加，治疗组则降低之。

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组别血浆cAMP(pmol/ml)肝组织耗氧量——————————————————————对照组71.76±18.94(n=21)385.04±45.36(n＝17)甲亢组98.05±27.09(n=23)*532.10±71.02(n=17)*治疗组80.89±31.11(n=17)465.03±109.07(n＝15)△*—————————————————————————————

*与对照组比p<0.01△与甲亢组比p<0.05

肝组织耗氧量：每分钟毫微克分子氧／100mg肝组织

糖皮质激素型阴虚模型建立法原理:

临床使用糖皮质激素治疗时，可发生欣快、失眠，不安，易激动的副作用，这些症状与阴虚类似。动物实验发现大剂量醋酸可的松对甲状腺的作用是先促进后抑制。在用大剂量氢化可的松制作小鼠阳虚造型时，发现助阳药对造型早期无效，滋阴药有一定作用。在造型后期则助阳药有效，滋阴药无效。因而显示氢化可的松造型早期为阴虚表现。二、阳虚证模型阳虚则阴盛，阳虚则外寒。因此凡属阳虚证者，均有寒象。阳虚有肾阳虚、脾阳虚等。由于肾为先天之本，又为气之根。因此一般阳虚证常涉及肾阳虚。补阳都从补肾入手，补阳药一般也都是补肾阳的药物。肾阳虚的主要表现是全身功能衰退，一般症状有神倦，畏寒肢冷，腰膝酸软，舌质淡白，脉沉而弱。因此实验动物模型大都根据这些原理设计。

阳虚证的发生原理，尚未完全阐明。根据临床和实验资料，认为与内分泌功能和能量代谢失调有关。造模材料：小鼠，雄性，体重25～35g，醋酸氢化可的松注射液或可的松、氢化可的松注射液或地塞米松。造模方法：可的松或氢化可的松给小鼠灌服，或肌肉注射15～30mg/kg，每天1次，连续5～7d;或给小鼠以醋酸氢化可的松25～62.5mg/kg肌肉注射，连续8～10d。造模原理：大剂量氢化可的松促进动物蛋白质、脂肪的大量分解，“阳虚”大鼠血浆ACTH含量昼夜总体水平显著降低，垂体、肾上腺、生殖腺组织发生退行性病变，肝、脾重量减轻，RNA和DNA合成减少，细胞免疫和体液免疫功能降低，外周微循环血管开放数目减少，血浆cGMP水平增高，cAMP水平相对降低，血浆皮质醇水平增高，肝糖原增加。

阳虚证造模后的指标变化：阳虚小鼠模型建成后，小鼠出现的“阳虚”症状：厌食，体重减轻、活动减少、反应迟钝、卷曲拱背、形寒肢冷、耗氧量减少。游泳能力和耐冻能力减低，且死亡率随造型天数而增加。例：肾阳虚模型组：氢化可的松25mg/kg肌内注射)；生精胶囊大、中、小剂量组：生精胶囊2.4、1.2、0.6/kg，口服；同时肌内注射氢花可的松25mg/kg；五子衍宗丸组：五子衍宗九1.2g/kg，口服。同时肌内注射氢花可的松25mg/kg，每日1次，连续4次。组

别剂量体重（g）游泳时间(g/kg)药前药后（min）正常对照组28.9±0.9832.7±4.125.4±3.0模型组28.9±0.8729.8±1.6*20.3±3.3**生精胶囊2.427.8±0.7932.6±1.6ΔΔ23.24±2.9Δ*1.226.4±0.9432.4±2.723.8±4.80.627.0±1.032.3±1.8Δ23.7±3.9Δ五子衍宗丸1.226.4±1.232.6±2.4ΔΔ23.1±4.3生精胶囊对肾阳虚模型小鼠的影响(X±s；n＝l0)

注：与正常对照组比较*P<0.05，**P<0.01；Δ与模型组比较P<0.05，ΔΔP<0.01。

羟基脲型阳虚模型建立法原理阳虚动物的虚损表现与核酸代谢，特别是脱氧核糖核酸(DNA)代谢低下有关。抗肿瘤药羟基脲能抑制核苷酸还原酶，从而抑制DNA合成，影响蛋白质代谢，出现一系列虚损症状。操作方法

取体重22～28g雄性小鼠。以羟基脲5～15mg／只灌胃。连续7～15日，可出现阳虚症状（以7.5mg较为合适）。例：取小鼠以羟基脲7.5mg／只，灌胃造型，治疗组以补阳药(淫羊藿和肉苁蓉等量制成煎剂，浓度为生药1g／ml，煎剂0.5ml／只，连续给药13日。末次给药后每只小鼠腹腔注射氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR)6微居里，1h后取动物肝、脾，测定DNA合成速率。结果：与阳虚组比较，补阳组肝脾DNA合成率较高，体重增加，耐冻时间较长。

补阳药对阳虚小鼠的影响

(x±s)增重耐冻时间(min)肝脾DNA合成率对照组6.5±0.94170.2±15.5(n=9)11560±1980(n=8)阳虚组－1.1±0.74*△119.5±6.7**(n=l0)5600±848*(n=8)治疗组5.4±1.23206.0±12.3△(n=10)9900±1660△(n=9)

与对照组比，*P<0.05；与对照组比，**P<0.01；

△与阳虚组比P<0.01。DNA合成率单位为每分钟cpm／mg·DNA肝、脾DNA测定原理分别取出肝、脾，用冷生理盐水洗净，滤纸吸干表面水分，称重，在冰浴中剪碎，加冷匀浆液（0.15mol/LNaCl,0.1mol/LEDTA,pH7.5-8.0），制备匀浆，以纱布过滤，3500r/min离心15min。取沉淀加入2ml匀浆液，搅匀，放置达室温，加入纯化的十二烷基磺酸钠(SDS),使其终浓度为1.6％。于三角烧瓶中加玻璃珠振荡摇匀，再加固体氯化钠，浓度达1mol/L,振荡20min,再加等体积氯仿，剧烈振荡20min,3500r/min离心15min。上层水加入2倍体积无水乙醇，即可见DNA呈胶链析出。用玻璃棒卷出此白色纤维状粗制DNA，以丙酮、乙醚冲洗，干燥后称重。取4－9mgDNA，加闪烁液，用液体闪烁计数仪测定脉冲值，按1mgDNA每1min的脉冲值计算。

甲减型阳虚模型建立法切除甲状腺造型法原理

甲状腺功能减退者(甲减)，体内的代谢普遍减慢，基础代谢率降低，中医辨证甲减患者大多具有脾肾阳虚症状，以温肾补阳药治疗，临床症状好转，基础代谢率升高，血浆cAMP升高。因此切除甲状腺造成的“甲减”动物模型，可模拟人类的阳虚证。

操作方法

取体重100～150g大鼠。在乙醚麻醉下切除双侧甲状腺，造成甲减大鼠模型，手术6～8星期后用于实验。三、血瘀证动物模型1．高分子右旋糖酐静脉注射造模法造模材料：高分子右旋糖酐又名高分子葡聚糖，平均分子量为20万～40万；家兔或新西兰大白兔。造模方法：高分子右旋糖酐，经加热，使完全溶解于生理盐水中，配成10％浓度的溶液。用9号针头经耳缘静脉，以15ml/kg的剂量快速注入10％高分子右旋糖酐，全量应在3min内推注完毕。一般在推注到全量1／3左右时，微循环中即出现以血细胞聚集为主的各种微循环障碍表现，并可持续12～24h。造模原理：高分子右旋糖酐能被红细胞吸附，从而在红细胞间起着桥梁作用，导致红细胞聚集，血流阻力增加，循环不畅。造模后的指标变化：除出现口唇紫绀，舌质暗红等血瘀症状外，还可见体内微循环血流缓慢、血细胞聚集、微血管周围有渗出及出血等现象，血黏度升高、红细胞电泳时间延长等明显的微循环障碍特征。家兔连续灌胃(ig)给绞股蓝总甙或水7d，每天1次。在给药到第7d，由家兔耳缘静注10％高分子右旋醣酐生理盐水10ml/kg，15min后，由颈总动脉插管放血。川芎嗪组在取血的前1天及当天ip60mg/kg川芎嗪，10min后耳缘静脉注高分子右旋醣酐，15min后动脉取血测血液流变学各指标。各项测定值均以x土s表示，进行组间t测验组别动物数（只）全血粘度(mpas)

（200/s）全血粘度(mpas)（30/s）全血粘度(mpas)（3/s）血浆粘度(mpas)水对照组

102.62±0.213.42±0.397.68±1.201.43±0.22模型组113.49±0.33###4.65±0.58###14.3±3.15##2.62±0.50###绞股蓝总甙200g/kg113.09±0.30**4.09±0.48**10.78±2.34**2.26±0.48绞股蓝总100mg/kg113.32±0.454.33±0.6511.19±2.70*2.42±0.35绞股蓝总甙50mg/kg113.17±0.45**4.22±0.7011.70±2.57*2.13±0.32*川芎嗪射液60mg/kg113.30±0.424.37±0.6910.94±2.74*2.60±0.36

肝气郁结和寒凝血瘀原理

寒入经脉造成经脉挛缩拘急，血液凝涩不能通畅而瘀滞。情绪暴怒时，机体分泌大量肾上腺素，使红细胞聚集指数增加，故给予大量肾上腺素可模拟机体暴怒时的变化，并以冰水浸泡模拟寒邪入侵经脉的血瘀模型。方法大鼠，200～250g。每次皮下注射0.1%肾上腺素0.2ml/只，每日2次，此间将大鼠放入冰水浸泡1次(5min)，如此处置1～2天。观测内容

①凝血时间：缩短；②血液流变学：血液黏度提高、红细胞电泳时间延长、红细胞聚集指数、刚性指数增加；③血沉加快。

生莪术组、制莪术组和生理盐水组灌胃给药5d，每天给药1次，每次5ml／只。末次给药1h后复制血瘀模型，即大鼠注射肾上腺素2次，并在2次注射之间结合冰水浸泡（5min)，次晨取血检测。生理盐水正常组则不复制动物模型，直接于次晨取血。按文献检查全血比粘度、血清比粘度、血浆比粘度和红细胞(MC)压积。莪术炮制前后对大鼠血液流变性的影响（x±s）组别

全血比粘度

血清比粘度血浆比粘度RBC压积低切变率高切变率生莪术11.82±2.13**5.04±0.61*1.88±0.172.15±0.14*45.12±2.34制莪术9.43±1.01**4.89±0.95*1.87±0.191.97±0.13**43.65±2.14*血瘀模型17.11±4.356.34±1.121.89±0.282.36±0.2446.34±2.31生理盐水8.80±1.13**4.72±0.52**1.82±0.101.82±0.09**42.21±3.20*注：与血瘀模型组比*p<0.05，**p<0.01。静脉血栓形成造模法：原理：静脉结扎引起血流淤滞，局部血管可因缺血致血管内皮损伤，暴露内皮下的胶原纤维，从而激活凝血因子XII，启动内源性凝血系统。凝聚的血小板与局部形成的凝血因子致使局部血栓形成，活血化瘀药物对此有抑制作用。方法：大鼠麻醉（40mg/kg戊巴比妥纳）后，仰位固定，沿腹正中线切开皮肤3cm左右，打开腹腔，推开肠子，找到下腔静脉并分离，于左肾静脉下方用粗丝线接扎下腔静脉，缝合腹壁。观察内容:2小时后，重新打开腹腔，在结扎下方2cm处用止血夹夹住血管，取注射器将该段血管内血液吸尽，然后纵向剪开管腔，观察有无血栓形成，如有，取出血栓在滤纸上吸干表面的水分、血液，称取湿重，然后真空干燥或800C左右常压干燥致恒重（一般干燥24小时即可）称取血栓干重。比较给药组和模型组区别。钩藤碱（Rhy）抗静脉血栓形成的作用ivwt(mg)dry(mg)control9.80±2.023.20±0.6Rhy10mg/kg5.80±1.20**1.80±0.40*Rhy20mg/kg3.20±1.20**1.10±0.30**ASA5mg/kg7.80±0.90**2.40±0.40**四、血虚证动物模型1．环磷酰胺造模法造模材料：昆明种小鼠，20～24g，雌雄各半，环磷酰胺。造模方法：动物腹腔注射环磷酰胺50～100mg／kg，每天1次，连续注射2～4d，然后饲养观察。造模原理：环磷酰胺破坏骨髓造血细胞增殖能力，所造成的贫血与临床再生障碍性贫血相似，可作为血虚的动物模型。造模后的指标变化：黏膜、唇、爪苍白，活动无力，精神萎靡，毛发蓬乱。白细胞和血小板明显减少，造模后动物骨髓有核细胞数减少，脾脏、胸腺的重量有一定的下降。黄芪对环磷酰胺造成小鼠造血功能抑制的影响（均数±s）与正常组比较＃＃P<0.01与模型组比较**P<0.01组别剂量（g/Kg）动物数(n)WBC(×109/L)骨髓有核细胞数（×107）正常109.56±6.060.989±0.270CY122.42±0.65＃＃0.406±0.098＃＃CY＋黄芪20104.14±1.44**0.630±0.191**组别剂量（g/Kg）动物数(n)WBC(×109/L)骨髓有核细胞数（×107）正常10128.48±2.22**1.591±0.350**模型组10121.50±1.000.285±0.172黄芪10123.60±2.10**1.141±0.621**辐射损伤法－60Co-γ3.5～4.0Gy黄芪对辐射造成的小鼠造血功能抑制的影响（x±s）与模型组比较**P<0.01上述化学法（环磷酰胺）、物理法（如60Co6Gyγ—射线照射）各有优缺点，如：单纯采用环磷酰胺造模发现外周血白细胞数量下降显著，而红细胞数量下降缓慢且不显著；单纯采用放射线造模剂量不易控制，易致小鼠死亡。所以很多人采用复合模型。脾结节：射线损伤骨髓造血干细胞后，少量造血干细胞可在脾脏增殖分化，射线照射9~11天，取小鼠脾脏，以苦味酸－甲醛固定一天后测定脾脏表面小结，即为内源性脾集落数。失血性血虚造型法

原理：

人工造成动物失血，使血液中红细胞(RBC)减少，血红蛋白(Hb)降低。操作方法：

取体重20g左右雄性小鼠，以75％乙醇棉球擦拭尾部，使血管扩张充血，剪去鼠尾尖端(0.25～0.3cm)，立即采血测定Hb及计数RBC，然后将鼠尾伤口浸入37℃左右温水中，使小鼠失去血液约0.5ml,于失血后24h再次放血0.5ml，48h后再在小鼠尾端采血测定Hb、RBC值。如Hb、RBC值均显著低于正常值则可，否则再次放血。检测指标

RBC计数,Hb浓度.溶血性血虚造型法

原理：

乙酰苯肼(acetylphenylhydrazine，APH)是一种强氧化剂，通过干扰还原型谷胱甘肽的生成而使红细胞膜的稳定性遭到破坏，导致溶血性贫血。据此，有人用乙酰苯肼制造大鼠血虚模型。操作方法：

取体重180～250g雄性大鼠，于第1，第4、第7日皮下注射2％APH生理盐水溶液，第1次剂量为10ml／1kg，第2、3次剂量减半。第9～14天可出现溶血性贫血。黄芪对溶血性贫血小鼠血象的影响（均数±s）与模型组比较*P<0.05,**P<0.01组别剂量（g/Kg）动物数(n)RBC(×1012/L)红细胞压积（％）Hb(g%)正常107.90±1.16**42.6±4.3**13.2±2.00**APH104.51±0.8231.4±4.47.3±1.0APH＋黄芪20105.17±0.9637.3±2.9**9.0±1.8*五、脾虚证动物模型

脾为后天之本，其生理功能按现代医学观点来看，包括消化、吸收、转运、代谢、营养等多方面功能。脾虚是脾功能不足，包括脾不健运、脾虚下陷、脾不统血、思虑伤脾等不同表现，出现消化不良、泄泻、脏器下垂、水肿、出血、抵抗力下降等各种功能障碍，中医常用益气健脾方药治疗。

大黄型脾虚造型法

原理

大黄苦寒，又致泻，连续服用能伤脾胃以致脾虚，用于动物造型，可使动物出现纳呆、消瘦、体重下降、泄泻、四肢无力、体温偏低、甚至中气下陷脱肛。按中医理论阳虚则外寒，故本模型属脾阳虚型。操作方法:

取体重18～20g小鼠，以100％大黄水煎液0.8ml／只灌胃，连续1~2星期；或用大鼠每次灌胃200％大黄水浸煎剂2.0～2.5ml／只，每日2次，连续2~3星期，或用大鼠每次灌胃15％大黄粉悬液3～5ml／只，每日2次，连续14日。均可出现上述脾虚症状。检测指标:一般体征：有溏便、消瘦、少动、四肢无力、脱肛、毛发枯涩、畏寒、耐寒力低等。消化功能：D-木糖吸收率明显降低，血清淀粉酶活性下降，胃液量减少。免疫功能：胸腺萎缩，体液及细胞免疫功能下降。右旋木糖吸收试验

原理:

木糖是五碳糖，口服后可直接在小肠吸收，不需消化酶参与。吸收后在体内不被肝脏代谢，经肾排出。因此，如以定量木糖口服，在规定时间内测定血或尿内木糖量，即可了解小肠的吸收功能。木糖在酸性溶液中加热后形成麸醛，后者可同二羟基甲苯作用呈绿色反应。淀粉酶活性测定法比色法测定淀粉酶原理：

淀粉酶能促进多糖分子中α-1，4-葡萄糖苷键水解。用已知浓度的可溶性淀粉为基质，经酶水解后，使剩余的淀粉与碘作用生成蓝色。酶活力愈低，剩余淀粉愈多，蓝色愈深。操作方法：

取50ml刻度试管2只，一只作对照管，另一只为测定管。两管内各加0.04％可溶性淀粉溶液5ml。将试管置37℃水浴内预温2～5min后分别加入待测标本(血清、尿液或消化液)或对照液0.1ml，混匀，再置37℃水浴内7.5min后取出。于对照管、测定管内各加入0.01mol／L碘应用液5ml，并用蒸馏水稀释至50ml刻度。立即混匀，660nm进行比色。以蒸馏水校正光密度到零点，读取各管光密度值。

在37℃30min内，100ml血清中淀粉酶能完全水解淀粉10ml时称为1个淀粉单位。计算方法如下：淀粉酶单位／100ml=[(对照管光密度—测定管光密度)/对照管光密度]×500

利血平型脾虚模型法原理：

慢性给予小剂量利血平，使小鼠体内单胺类介质耗竭。出现交感神经功能偏低，副交感功能偏高，体温下降，体重下降，肠运动增加，及泄泻等类似脾虚症状。操作方法：

取体重20～25g小鼠。以利血平0.1mg／kg皮下注射，连续14日，即形成利血平化脾虚型小鼠。

检测指标：一般体征：有溏便、纳呆、消瘦、少动、四肢无力、脱肛、毛发枯涩、畏寒、耐寒力低等。免疫功能：胸腺萎缩，体液及细胞免疫功能下降。六、热毒证动物模型发热是实热证的重要体征之一。许多清热方、药都有明显解热作用，如白虎汤、黄连解毒汤、银翘散、大青叶、板蓝根、玄参、竹叶，知母、石膏等都有明显解热作用。解热试验是研究清热解毒的常用指标。