结核病病理学诊断规范

T/CRHAXXX-202X团体标准ICS 11.020CCSC05T/CRHAXXX—202X————————————————————————————————结核病病理学诊断规范Specificationforpathologicaldiagnosisoftuberculosis（征求意见稿）20232023-08-01实施

中国研究型医院学会发布20232023-08-01实施XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施结核病病理学诊断规范1范围。本文件适用于全国各级医疗机构病理医务人员进行结核病病理学诊断。2规范性引用文件所有的修改单）适用于本文件。WS288—2017肺结核诊断标准《临床技术操作规范：病理学分册》3术语和定义下列术语与定义适用于本标准。3.1肺结核pulmonarytuberculosis发生在肺组织、气管和支气管的结核病变。肺结核病原学详见WS288—2017附录A。3.2结核分枝杆菌mycobacteriumtuberculosis简称结核杆菌，是人类结核病的病原菌。结核分枝杆菌的形态为细长直或稍弯曲、两端圆钝的杆菌，长1μm～4μm，宽0.3μm～0.6μm。3.3肉芽肿granuloma由巨噬细胞及其演化的细胞局限性浸润和增生所形成的境界清楚的结节状病灶。3.4非结核分枝杆菌nontuberculousmycobacteria分枝杆菌属内除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。3.5非结核分枝杆菌病nontuberculousmycobacteriadiseases机体感染非结核分枝杆菌后出现相应的临床症状、体征和影像学表现，具有病原学和/或病理学证据。4缩略语PAS——过碘酸盐希夫染色（PeriodicAcidSchiffStain）HE染色法——苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosinStaining)PCR——荧光聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction）HRM——高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）NTM——非结核分枝杆菌（NontuberculousMycobacterium）GPA——肉芽肿性多血管炎（GranulomatosisWithPolyangiitis）ANCA——抗中性粒细胞胞质抗体（Anti-neutrophilCytoplasmicAntibodies）EGPA——嗜酸性肉芽肿多血管炎（EosinophilicGranulomatosisWithPolyangiitis）HNL——组织细胞坏死性淋巴结炎（HistiocyticNecrotizingLymphadenitis）5病理学特征5.1渗出性病变5.2增生性病变5.3坏死性病变6诊断主要技术6.1常规病理学诊断6.1.1大体检查6.1.2镜下检查6.2特殊染色（详细操作参见附录A）6.2.1抗酸染色。6.2.2六胺银（GMS）及过碘酸盐希夫（PAS）染色6.2.3网状纤维染色6.3分子病理学检测（详细操作见附录B）6.3.1实时荧光定量PCR技术6.3.2高分辨熔解曲线技术7诊断分级8鉴别诊断9诊断推荐流程附录A（资料性）特殊染色操作流程A.1抗酸染色A.1.1试剂配制a）碱性品红乙醇液：碱性品红5g无水乙醇100mlb）5%苯酚水溶液：苯酚（稍加温使其溶解）5ml蒸馏水95mlc）苯酚碱性品红液：碱性品红乙醇液1ml5%苯酚水溶液9mld）20%硫酸水溶液：浓硫酸20ml蒸馏水80mle）汽油松节油液：航空汽油（也可为普通汽油）1份松节油1份A.1.2染色程序a）组织块固定于4%中性甲醛液中，常规脱水、石蜡包埋和切片。b）切片用汽油松节油脱蜡2次，每次5～10min。c）不经乙醇洗，只用纱布将切片周围余液擦干。d）流水稍洗。e）滴入苯酚碱性品红液，于室温下染15～30min。f）流水洗去多余染液。g）用20%硫酸水溶液分化至适当为止（一般需1～5min）。h）流水充分冲洗。i）用Mayer苏木精液浅染细胞核。j）流水冲洗10～15min。k）用风扇把切片吹干，随即二甲苯透明，中性树胶封固。A.1.3染色结果抗酸杆菌呈鲜红色，胞核呈蓝色。A.2六胺银染色A.2.1试剂配制a）8%铬酸水溶液：铬酸8g蒸馏水100mlb）0.5%偏重亚硫酸钠液：偏重亚硫酸钠0.5g蒸馏水100mlc）5%硝酸银溶液：硝酸银250mg蒸馏水5mld）3%六次甲基四胺水溶液：六次甲基四胺3g蒸馏水100mle）5%四硼酸钠液：四硼酸钠5g蒸馏水100mlf）六胺银贮备液：5%硝酸银水溶液5ml3%六次甲基四胺水溶液100ml将3%六次甲基四胺水溶液加入5%硝酸银溶液中，随即形成白色沉淀;此沉淀在摇动中立即溶解。取澄清液置于4℃冰箱内保存，可在数月内使用。g）六胺银工作液：六胺银贮备液10ml蒸馏水25ml5%四硼酸钠液2ml将5%四硼酸钠液加入蒸馏水中，然后加入六胺银贮备液，搅拌混合后即可使用。h）1%氯化金水溶液：氯化金1g蒸馏水100ml先配制上述1%氯化金液贮存，另用蒸馏水与原液按9:1稀释成0.1%氯化金液。i）2%硫代硫酸钠液：硫代硫酸钠2g蒸馏水100mlj）亮绿水溶液：亮绿0.2g蒸馏水100ml冰醋酸0.2mlk）橙黄G染液：橙黄G2g蒸馏水100ml磷钨酸5gA.2.2染色程序1）组织块固定于4%中性甲醛液中，常规脱水、石蜡包埋和切片。2）切片脱蜡至水。3）8%铬酸水溶液氧化20min。4）自来水稍洗。5）5%偏重亚硫酸钠液处理1min。6）流水冲洗5min，再用蒸馏水洗2次。7）置入六胺银工作液于温箱内(58～60℃)60～90min，至切片呈黄褐色，即E显微镜下观察，见真菌呈黑褐色为止。8）蒸馏水洗。9）滴入0.1%氯化金溶液调色2～3min。10）流水稍洗。11）2%硫代硫酸钠液处理2～5min。12）流水冲洗5min。13）用亮绿液复染20～40s，或用橙黄G复染1～2s。14）快速水洗。15）95%乙醇和无水乙醇脱水。16）二甲苯透明，中性树胶封固。A.2.3染色结果各种真菌均被着色。菌丝和孢子呈明显的黑褐色，抗酸杆菌也呈黑褐色。背景为淡绿色（用亮绿复染时）或橙黄色（用橙黄G复染时）或红色（用伊红复染时）。A.3过碘酸盐希夫（PAS）法A.3.1试剂配制a）0.5%高碘酸水溶液：高碘酸0.5g蒸馏水100ml溶解后，用小口砂塞瓶盛装，置于4℃冰箱保存。使用前取出恢复至室温。b）0.5%偏重亚硫酸钠液：偏重亚硫酸钠0.5g蒸馏水100ml溶解后，用小口砂塞瓶盛装，置于4℃冰箱保存。使用前取出恢复至室温。c）无色品红液（Schiff试剂）：碱性品红1g蒸馏水200ml1N盐酸20ml偏重亚硫酸钠1～1.5g活性炭1～1.5g取一只500ml的洁净三角烧瓶盛蒸馏水200ml并煮沸，将碱性品红加入煮沸的蒸馏水中，摇动数分钟使碱性品红完全溶解(此时溶液为深红色);待溶液冷却至50℃时，过滤至另一只洁净三角烧瓶内，加入1N盐酸20ml;待溶液冷却至25℃左右时，再加入偏重亚硫酸钠，随即用胶塞塞紧瓶口，并轻轻摇动使其溶解，此时碱性品红液的颜色明显变淡。将溶液置于室温、暗处24h，此时溶液应呈淡稻草黄色或淡红色。加入活性炭粉，搅匀后，塞瓶口轻摇1～2min，静置1～2h;然后，将溶液通过双层滤纸过滤到小口砂塞瓶内，此时溶液应完全无色，即为无色品红，又称Schiff液，置于4℃冰箱内保存。d）亮绿水溶液：亮绿0.2g蒸馏水99.8ml冰醋酸0.2mlA.3.2染色程序1）组织块固定于4%中性甲醛液中，常规脱水、石蜡包埋和切片。2）切片脱蜡至水。3）0.5%高碘酸氧化5～8min。4）流水冲洗2min，再用蒸馏水洗。5）入无色品红液，于暗处并加盖作用10～20min。6）0.5%偏重亚硫酸钠液滴洗2次，每次约1min。7）流水冲洗5min。8）亮绿水溶液复染数秒。9）稍水洗。10）常规脱水、透明，中性树胶封固。A.3.3染色结果真菌呈品红色，组织呈绿色。A.4网状纤维染色A.4.1氢氧化银氨液浸染法（Ⅰ）A.4.1.1试剂配制a）Gordon-Sweets银氨液：用小量杯盛10%硝酸银水溶液2ml，逐滴加入氢氧化铵，边滴边摇动容器。先出现沉淀物，继续滴入氢氧化铵至所形成的沉淀物恰好溶解。加入3%氢氧化钠水溶液2ml，再次形成沉淀。继续滴入氢氧化铵，直至沉淀物再次恰好溶解。最后加蒸馏水至40ml，配好后用棕色砂塞瓶盛装，置于4℃冰箱内保存，使用前取出恢复到室温。b）酸化高锰酸钾水溶液：甲液：0.5%高锰酸钾水溶液高锰酸钾0.5g蒸馏水100ml乙液：0.5%硫酸水溶液硫酸0.5ml蒸馏水99.5ml甲、乙两液分瓶盛装，临用前等份混合。c）2%草酸液：草酸2g蒸馏水100mld）2%硫酸铁铵液：硫酸铁铵2g蒸馏水100mle）4%中性甲醛液：甲醛（40%）10ml蒸馏水90mlf）核固红染液：核固红0.1g蒸馏水100ml硫酸铝5g麝香草酚50mg先把硫酸铝溶于蒸馏水，然后加入核固红，稍加温溶解，冷却后过滤，最后加入麝香草酚。A.4.1.2染色程序1）组织块固定于4%中性甲醛液中，常规脱水、石蜡包埋和切片。2）切片脱蜡至水。3）酸化高锰酸钾液氧化5min。4）稍水洗。5）2%草酸水溶液漂白1～2min。6）稍水洗。7）2%硫酸铁铵水溶液媒染5min。8）稍水洗，再用蒸馏水洗1次。9）滴加Gordon-Sweet银氨液，作用1min。10）蒸馏水稍洗。11）4%中性甲醛液还原1min。12）流水冲洗5～10min13）以0.2%氯化金调色1～2min.14）蒸馏水洗。15）固定于5%硫代硫酸钠2min。16）用核固红液复染5～10min或行HE复染。17）稍水洗。18）常规脱水、透明，中性树胶封固。A.4.1.3染色结果网状纤维呈黑色，胞核呈红色(用核固红复染)或蓝色(用苏木精复染)，胶原纤维呈黄棕色，细胞质呈淡红色(用伊红复染)。A.4.2氢氧化银氨液浸染法（Ⅱ）A.4.2.1试剂配制a）Gomori银氨液配制:用小量杯盛10%硝酸银水溶液3份，加入10%氢氧化钾水溶液1份，即发生棕黑色颗粒沉淀，观察此溶液的总量并记下，加入10倍以上的蒸馏水洗涤沉淀物，然后倾去上清液，再加入蒸馏水。如此反复洗涤3次，最后加蒸馏水至原来记下的份量。然后滴入氢氧化铵并不断摇荡，直到沉淀物完全溶解。再次加入10%硝酸银水溶液数滴至溶液稍变混浊，再加入氢氧化铵一滴至数滴，使溶液再次变清。最后按原总量加蒸馏水10～15倍稀释，平时保存于4℃冰箱，用前取出恢复到室温。b）0.25%高锰酸钾水溶液高锰酸钾0.25g蒸馏水100mlc）2%草酸液：草酸2g蒸馏水100mld）2%硫酸铁铵水溶液：硫酸铁铵2g蒸馏水100mle）4%中性甲醛液：甲醛（40%）10ml蒸馏水90mlA.4.2.2染色程序1）组织块固定于4%中性甲醛液中，常规脱水、石蜡包埋和切片。2）切片脱蜡至水。3）0.25%高锰酸钾液氧化5min。4）稍水洗。5）2%草酸液漂白1～2min。6）稍水洗。7）2%硫酸铁铵水溶液媒染5min。8）稍水洗，再用蒸馏水洗1次。9）滴入Gomori银氨液作用3～5min。10）蒸馏水稍洗。11）4%中性甲醛液还原1min。12）流水冲洗5～10min。13）以0.2%氯化金调色1～2min。14）蒸馏水洗。15）固定于5%硫代硫酸钠2min。16）常规脱水、透明，中性树胶封固。A.4.2.3染色结果网状纤维呈黑色，胶原纤维呈黄至黄棕色，胞核呈灰褐色。附录B（资料性）分子病理学检测B.1实时荧光定量PCR技术B.1.1操作流程B.1.1.1切蜡卷1)更换新刀片或仔细擦拭刀刃正反面，清理刀架及切片机夹头周围的蜡屑；2)准备洁净的热压离心管，将组织蜡块号用标记笔标注于热压离心管盖及侧面；3)切蜡卷时弃掉最初的两卷，切片3-5μm即成蜡卷；4)用一次性棉签尾部刮取蜡卷两端的石蜡部分，平放入热压离心管中。一次切多个蜡块时应注意核对蜡块编号与离心管上的编号是否吻合。B.1.1.2组织消化1）向热压管中加入250μLDNA裂解液并将石蜡切片浸入其中（裂解液使用前充分混匀）；2）将专用热压管置于核酸提纯仪中，选择程序，启动机器；3）待热压结束，取出热压管，4℃13000rpm离心5分钟；4）取出热压管，避开上层蜡膜及管底沉淀物，吸取上清液（约200μL）至新的EP管中。B.1.1.3DNA抽提1）加入200μLA液，立即颠倒混匀（此时可能出现絮状沉淀物），再加入200μL无水乙醇，充分混匀（液体变得较清亮），瞬时离心；2）将上清小心转移到纯化柱中，10000rpm离心15秒；3）将纯化柱放入新的收集管中，加入500μLP1，10000rpm离心15秒；4）将纯化柱放入新的收集管中，加入500μLP2，10000rpm离心15秒；5）将纯化柱放入新的收集管中，13000rpm开盖离心15秒；6）将纯化柱放入新的EP管中，加入50～100μlB液，盖上盖子，室温孵育3～5分钟，13000rpm离心1分钟收集核酸；7）DNA置于-20°C±2℃保存，不超过一个月，长期保存于-80°C±5℃冰箱，不超过三年；B.1.1.4加样：向8联排PCR管中，每管加入PCR-混合液20μL，依次加入待测样本、阴性对照、阳性对照和阳性参照品各5μL。盖上管盖（去除气泡后），2000rpm离心15秒；B.1.1.5PCR扩增（参照各仪器使用说明书进行设置）B.2高分辨熔解曲线技术B.2.1操作流程B.2.1.1切蜡卷1）更换新刀片或仔细擦拭刀刃正反面，清理刀架及切片机夹头周围的蜡屑。2）准备洁净的热压离心管，将组织蜡块号用标记笔标注于热压离心管盖及侧面。3）切蜡卷时丢弃最初的两卷，切片3-5μm即成蜡卷。4）用一次性棉签尾部刮取蜡卷两端的石蜡部分，平放入热压离心管中。一次切多个蜡块时应注意核对蜡块编号与离心管上的编号是否吻合。B.2.1.2组织消化1）向专用热压管中加入250μLDNA裂解液并将石蜡切片浸入其中（裂解液使用前充分混匀）；2）将专用热压管置于核酸提纯仪中，选择程序，并按开始键。3）待热压结束，取出热压管，4℃13000rpm离心5分钟。4）取出热压管，避开上层蜡膜及管底沉淀物吸取清亮液体（约200μL）至新的EP管中；B.2.1.3DNA抽提1）加入200μlA液，立即颠倒混匀（此时可能出现絮状沉淀物），再加入200μl无水乙醇，充分混匀（液体变得较清亮），瞬时离心；2）将上清小心转移到纯化柱中，10000rpm离心15秒；3）将纯化柱放入新的收集管中，加入500μlP1，10000rpm离心15秒；4）将纯化柱放入新的收集管中，加入500μlP2，10000rpm离心15秒；5）将纯化柱放入新的收集管中，13000rpm开盖离心15秒；6）将纯化柱放入新的EP管中，加入50～100μlB液，盖上盖子，室温孵育3～5分钟，13000rpm离心1分钟收集核酸；7）DNA置于-20°C±2℃保存，不超过一个月，长期保存于-80°C±5℃冰箱，不超过三年。B.2.1.4打开PCR反应管管盖并丢弃，用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入25μL相应的提取样本或阴性/阳性对照品，之后立即盖严待用的透明PCR八联管管盖。B.2.1.5将已加入模板的PCR薄壁反应管于涡旋振荡器中充分振荡混匀20s，瞬时离心数秒，除去气泡。将离心后的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。B.2.1.6PCR扩增及熔解曲线分析扩增与熔解曲线分析步骤为一个程序，在全自动医用PCR分析系统上连续完成。程序运行完毕，将PCR薄壁反应管（闭管）取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。附录C（资料性）结核病鉴别诊断C.1结核病与其他感染性肉芽肿疾病的鉴别诊断C.1.1非结核分枝杆菌病NTM是分枝杆菌属除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌的统称，可以侵犯人体多种器官引发非结核分枝杆菌病，也可引起全身播散性疾病。非结核分枝杆菌病见于免疫功能低下的宿主和（或)之前有肺疾病的患者，包括慢阻病、肺结核、尘肺、支气管扩张和肺癌等。非结核分枝杆菌病病理变化与结核病非常类似，常为坏死性肉芽肿性炎。NTM与MTB均为抗酸阳性菌，形态非常相似，大多数情况下很难鉴别。要明确分枝杆菌的类型，需要进行分子病理检测或新鲜组织培养。C.1.2真菌病真菌病是由真菌感染引起的疾病，是除了分枝杆菌病以外最为常见的感染性肉芽肿疾病。诊断真菌病需要在病灶中找到真菌病原体，常见者为组织胞浆菌、隐球菌、芽生菌、球孢子菌、曲霉、毛霉等。很多真菌在HE切片可以识别，进一步识别需要结合特殊染色。常用的染色方法为六胺银和PAS染色，前者真菌染色为棕黑色，后者为红色。C.1.3奴卡菌病奴卡菌病是由奴卡菌引起的一种少见化脓性病变。奴卡菌是一种需氧革兰阳性丝状分枝杆菌，具有弱抗酸性，但部分奴卡菌抗酸染色也可呈弱阳性。奴卡菌形态与放线菌相似，是分枝发达的菌丝，但菌丝末端不膨大。奴卡菌的病理表现为亚急性或慢性化脓性炎，也可以表现为肉芽肿性病变，此外，在感染的组织内及脓液中也可发现类似硫磺样颗粒，是奴卡菌在组织中形成的菌落，具有一定的诊断价值。奴卡菌的分离与培养为诊断的“金标准”。奴卡菌抗酸染色可以阳性，因此需要应用分子病理检测技术与分枝杆菌进行鉴别。。C.1.4寄生虫病寄生虫病也可引起肉芽肿病变。常见寄生虫有肺血吸虫病和肺吸虫等，可引起动脉阻塞及坏死性肉芽肿病变，有时还可见到大量嗜酸粒细胞浸润。在坏死区或肺血管腔内可见少量病原虫，病原虫体积大，不需要特殊染色，在HE切片中就可以清楚识别。C.1.5麻风病麻风病是由麻风分枝杆菌引起的一种慢性传染病，病变主要累及皮肤和周围神经，可形成肉芽肿，亦可形成结核样结节，结节中心可见坏死。主要特点是病变对神经组织的侵犯。抗酸染色可在瘤型和界线型麻风病变找到大量麻风杆菌，但在结核型和未定型麻风病变中麻风杆菌非常少。明确诊断需通过基因检测进行菌种鉴定。C.2结核病与非感染性肉芽肿疾病的鉴别诊断C.2.1结节病结节病（sarcoidosis）是一种原因不明的、可累及全身多系统的非坏死性上皮样细胞肉芽肿为病理特征的系统性疾病，以肺和肺内淋巴结受累最为常见。光镜下可见上皮样细胞形成的肉芽肿样结节，结节大小较一致，界限清晰，较少发生融合。结节内可见多核巨细胞及薄壁小血管，并无干酪样坏死，有时肉芽肿结节中央可见纤维素样渗出物；有时在多核巨细胞胞浆中可见星状小体及紫蓝色同心环层小体即绍曼小体，但不具有特异性；结节周围纤维组织增生包绕，嗜银染色结节内外网织纤维增生明显；肺结节病的肉芽肿结节主要在肺间质，沿支气管血管、淋巴管及胸膜下分布。目前结节病的诊断主要依靠临床、影像学和病理学资料进行综合判断，在受累部位组织活检明确为非干酪样坏死性上皮样细胞肉芽肿的基础上，结合患者的临床、影像学表现，除外其他病因后可确诊为结节病。需要注意的是，约20%的结节病患者可以出现肉芽肿内的坏死，这是需要进行特殊染色和分子病理检测与分枝杆菌、真菌等感染性疾病鉴别。C.2.2肉芽肿性多血管炎（GPA）既往称为韦格纳肉芽肿病，是一种全身系统性疾病，常累及肺、上呼吸道和肾脏。临床多表现为发热、体重下降、咳嗽、胸痛及咯血等。一般双肺可见多发结节，界限较清。患者血清抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)，特别是胞质型ANCA常阳性。支气管镜活检和细针肺穿刺活检常因组织少而不能明确诊断，多采用开胸或胸腔镜取较大组织活检。GPA组织学特点是坏死性肉芽肿性炎伴血管炎，病变部位有大片坏死区，坏死区呈嗜碱性不规则地图样，病变区的小动脉和静脉出现血管炎改变。血管有灶性坏死及肉芽肿形成，急性及慢性炎细胞浸润伴纤维素样坏死。抗酸染色、PAS染色可与分枝杆菌病及真菌病鉴别。C.2.3嗜酸性肉芽肿多血管炎（EGPA）是一类涉及中、小动脉的系统性血管炎。常见受累器官包括肺、心脏、肝脏、脾、皮肤及周围神经等。主要的临床特点有合并支气管哮喘，外周血嗜酸粒细胞达1500/μl或外周血白细胞分类中嗜酸粒细胞比例>10%，累及2个或更多肺外器官的系统性血管炎等。患者血清核周型ANCA常阳性。诊断常常通过肺外活检组织进行，主要包括皮肤、神经组织及肌肉组织等。主要的病理特点是嗜酸粒细胞浸润、坏死性血管炎及血管外肉芽肿性炎。C.2.4坏死性结节病样肉芽肿病是一种原因不明、少见的主要累及肺部的肉芽肿性疾病。临床上，女性多见，常表现轻微咳嗽、低热等症状发病，罕见咳血。胸部影像常为双侧多发或单发结节状高密度影，镜界限清，部分病例可见空洞形成。组织学表现为丰富的非坏死性上皮样细胞肉芽肿结节，大片凝固性坏死及血管炎，结节周围可见多核巨细胞。坏死可呈嗜伊红染色均质状的非干酪样凝固性坏死。血管炎可为血管壁淋巴细胞浸润或管壁有肉芽肿病变，可压迫并堵塞其官腔，肉芽肿性血管炎阻塞导致的梗死样坏死是坏死性结节病样肉芽肿病较为独特的病变特点。坏死性结节病样肉芽