GB∕T 39101-2020 多肽抗菌性测定 抑菌圈法

ICS07.080A40中华人民共和国国家标准多肽抗菌性测定抑菌圈法2020-09-29发布2021-04-01实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会ⅠGB／T39101—2020本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。本标准起草单位：北京工商大学、河北科技大学、深圳市计量质量检测研究院、河北农业大学、北京萨姆伯科技有限公司、武汉明了生物科技有限公司、浙江东杰生物科技有限责任公司、市场监督管理总局食品审评中心、中国测试技术研究院生物研究所。本标准主要起草人：贾英民、马爱进、王志新、田益玲、郝帅、彭海、周李华、杨志坚、郑燕燕、郑刚、1GB／T39101—2020多肽抗菌性测定抑菌圈法本标准规定了多肽抗菌性的抑菌圈测定方法。本标准适用于多肽抗细菌性能和抗丝状真菌性能的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1多肽介于氨基酸和蛋白质之间，由2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。3.2抑菌圈固体培养基表面与试样接触边界处无菌繁殖的环带区域。3.3抗菌性抑制微生物繁殖的能力，以抑菌效价U值(AU)来表示。利用多肽在固体平板中与测试指示菌接触后，使其周围的菌株生长受到抑制，形成无菌繁殖区域，根据测试菌在固体平板表面表现出的抑菌圈直径，计算抑菌效价U值来判定活性。5试剂或材料除非另有说明，本方法所用的试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的一级水。0.85%生理盐水：称取8.5g氯化钠于容量瓶中，用一级水溶解并定容至1000mL。121℃±1℃高压蒸汽灭菌20min。2GB／T39101—2020营养肉汤培养基(NB)、营养琼脂培养基(NA)、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA),配制参见附录A。5.3指示菌标准菌株藤黄微球菌蜡样芽孢杆菌鼠伤寒沙门氏菌铜绿假单胞菌丝状真菌黑曲霉产黄青霉桔青霉citrinum）CICC2478(ATCC9849)。6仪器设备电子天平感量为分光光度计波长范围为6.4游标卡尺或抑菌圈测量仪：精度0.02mm~0.1mm。血球计数板格格或格格6.6玻璃平皿：直径为90mm,底部平整。不锈钢牛津杯内径外径高7试验步骤7.1抗细菌性能测定称取多肽样品10.0mg,水溶性好的样品采用无菌缓冲液溶解与定容，水溶性差的样品先溶于无水乙醇再用无菌缓冲液定容至1.0mL,使其浓度为10.0mg/mL,作为储备液，4℃~6℃冰箱中保存，应在一周内使用。使用时，采用无菌缓冲液将多肽储备液进行稀释，制备成至少5个不同浓度的待测溶将指示菌接种于培养基的试管培养进行第一次传代培养；取第一代培养液接种于5.0mLNB培养基的试管，36℃±1℃、200r/min±1r/min培养18h~24h进行第二次传代培养；取第二代培养液接种于5.0mLNB培养基的试管或50.0mLNB培养基的锥形瓶，36℃±1℃、200r/min±1r/min培养至指示菌的稳定期，作为第三代培养液。3GB／T39101—2020预先按照GB4789.2进行指示菌的菌落计数，建立菌落数与吸光度值(OD600)的对应关系；将第三代培养液调整至合适的吸光度值，使其菌悬液浓度为1×108CFU/mL~5×108CFU/mL。将配制的NA培养基加热溶解，冷却至45℃~50℃,将制备的指示菌菌悬液按照1%的添加量加入NA培养基中，充分混合均匀，量取20mL倾倒入灭菌平皿，轻轻摇动平皿使之均匀铺平，待其凝固后备用。在含有指示菌的检测平板中等距离安放5个~6个牛津杯，轻轻按压，量取多肽样品100μL,缓缓加入牛津杯中，每个处理重复3次。将平板移入4℃~6℃冰箱中预扩散4h~10h,取出平板，放入36℃±1℃恒温培养箱中，正置培养至抑菌圈清晰，采用游标卡尺或抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径，每个抑菌圈沿不同方向测量3次，并记录平均值。以多肽稀释倍数倒数的对数值为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，建立线性方程（R2≥0.9900)。杆菌肽对S．aureusATCC25923的线性关系图参见附录B的图B.1。7.2抗丝状真菌性能测定7.2.2指示菌孢子悬液制备将指示菌孢子或菌悬液接种于PDA培养基的固体平板上，29℃±1℃恒温培养48h~72h,作为第一代孢子培养物；取第一代孢子培养物接种于PDA培养基的固体平板上，29℃±1℃恒温培养48h~72h,作为第二代孢子培养物；取第二代孢子培养物接种于PDA培养基的固体平板上，29℃±1℃恒温培养48h~72h,作为第三代孢子培养物。将第三代孢子培养物用0.85%生理盐水洗脱孢子，血球计数板计数，将孢子浓度调整至1×7.2.3检测平板制备将配制的PDA培养基加热溶解，冷却至45℃~50℃,将制备的指示菌孢子悬液按照1%的添加量加入PDA培养基中，充分混合均匀，量取20mL倾倒入灭菌平皿，轻轻摇动平板使之均匀铺平，待其凝固后备用。在含有指示菌的检测平板中等距离安放5个~6个牛津杯，轻轻按压，量取多肽样品100μL,缓缓加入牛津杯中，每个处理重复3次。将平板移入4℃~6℃冰箱中预扩散4h~10h,取出平板，放入29℃±1℃恒温培养箱中，正置培养18h~24h至抑菌圈清晰，此时指示菌为菌苔状，基本还未形成菌４GB／T39101—2020丝；采用游标卡尺或抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径，每个抑菌圈沿不同方向测量３次，并记录平均值。以多肽稀释倍数倒数的对数值为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，建立线性方程（R２≥。硫酸多粘菌素Ｂ对A．的线性关系图参见图。8试验数据处理抗菌性按式计算：式中：U—抗菌效价，单位为每毫克V—样品的测定体积，单位为毫升X—线性方程的X轴截距；C—样品的初始测定浓度，单位为毫克每毫升。计算结果以３次平行测定值的算术平均值表示，保留两位有效数字。5GB／T39101—2020附录A（资料性附录）培养基营养肉汤培养基7.4,分装后于高压蒸汽灭菌器中，121℃±1℃灭菌20min。A.1.2可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。营养琼脂培养基值至分装后于高压蒸汽灭菌器中，灭菌A.2.2可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。马铃薯-葡萄糖琼脂培养基A.3.1将去皮切块马铃薯200g放入1000mL一级水中，煮沸10min~20min,用纱布过滤，补加一级水至加入葡萄糖琼脂加热溶化调节值至灭菌20min。A.3.2可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。6GB／T39101—2020附录B（资料性附录）抗菌性测定线性关系图B.1抗细菌性能测定杆菌肽二倍梯度稀释5个浓度，浓度范围为0.0625mg/mL