SNT 1196-2012 转基因成分检测 玉米检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准转基因成分检测玉米检测方法2012-12-12发布2013-07-01实施本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。——增加了鉴定检测玉米品系范围，补充了MON863、NK603、TC1507、MON88017、59122、本标准参照ISO标准和欧盟联合研究中心转基因食物及饲料参考实验室(Communityreference法实时荧光PCR方法。12Cry9C:insecticidal-activeftruncatedproductidenticaltothatofCry9CgeneofBacillusthurIVR:invertase1genefrommaize,玉米的转化酶1基因IVS2:intronfromthemaizealcoholdehydrogenasegene,玉米乙醇脱氢酶基因的基因内区2mEPSPS:maize5-enolypyruvylshikimate-3-phosphatesynthase,来源于玉米的莽草酸羟基乙酰转NOS:terminatorofnopaliPactin1:thepromoterderivedfromtherice(Oryzasativa)actin1gene,来源于玉米肌动蛋白1PAT:phosphinothricinacetyltransferasegPCR:polymerasechainreTris:tris(hydroxymethyl)aminomethane,36.2.970%乙醇。6.2.17UNG酶(UracilN-glycosylase)。6.4.2模板DNA提取4PCR反应体系见表1,每个样品各做两个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全落入反应液中，50μL反应体系10×PCR缓冲液dNTP(含dUTP)引物模板DNA~6μg/L注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增模板量；也可根据具50℃PCR前去污染2min,94℃预变性2chin。94℃变性40s,55℃~58℃退火60s,72℃延伸用电泳缓冲液(1×TBE或TAE)制备%琼脂糖凝胶(其中在55℃~60℃左右加入EB或其他染用针对玉米内源基因IVR基因(或Zein基因)设计的引物对玉米DNA提取液进行PCR测试，待测样品应被扩增出226bp(或173bp)的PCR产物。如未见有该PCR产物扩增，则说明DNA提取质对玉米样品DNA提取液进行外源基因的PCR测试，如果阴性目标DNA对照和扩增试剂对照未5TC1507、MON863、NK603、Bt10的结构特异性基因或品系特异性基因，以确定是何种转基因玉米见6.4.1。7.4.2模板DNA提取见6.4.2。6终浓度μL/反应10×PCR反应缓冲液5MgCI,(25mmol/L.)51111UNG酶(1U/μL)111Taq酶(5U/μL)DNA模板(40ng/μL～50ng/μL)5 注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量；也可根据具表3实时荧光PCR反应体系(2)终浓度μL/反应TaqManUniversalPCRMasterMix(2×)DNA模板(40ng/μL～50ng/μL)注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量；也可根据具实时荧光定量PCR的反应参数为：50℃PCR前去污染2min;预变性95℃10min;95℃15s,7按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放(上机前应注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器),开始运行仪器进行实时荧光PCR反应。实时荧光PCR反应结束并分析结果后，应设置无效基线范围。无论采用任何荧光通道(FAM或TET),基线范围选择在3～15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性目标DNA对照扩增曲线的最高点，且Ct值=40为准。扩增试剂对照：外源基因检测Ct值大于或等于40,内源基因检测Ct值大于或等于40。若筛选检测结果阳性，则需进一步鉴定检测MON810、Bt11、Bt176、T14/T25、CBH351、GA21、待测样品外源基因检测Ct值大于或等于40,内源基因检测Ct值小于或等于24,设置的对照结果待测样品外源基因检测Ct值小于或等于36,内源基因检测Ct值小于或等于24,设置的对照结果待测样品外源基因检测Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct89(规范性附录)表A.1检测转基因玉米内、外源基因所需的引物信息类别引物序列内源内源5’-ccgctgtatcacaaggg5'-ggagccggtgtagagcatgacgate-3”5'-gatagtgggatigtgcgtca-3’5'-tcatccctacgtcagtggag-3’5'-ttatcctagtttgcgcgcta-3’5'-attgcgggactctaatcata-3’5'-cgccttgagcctggcgaacag5'-gtcgcatgtctctggagag/3’5'-gcaadcaaccaagggtatc-3’5'-actcggccgtccagtegta3’5'-ctgggaggccaaggtatctaat-3’5'-gctgctgtagctggcctaatct-3’5'-tcgaaggacgaaggactctaacg-3’5'-tccatctttgggaccactgtcg-3’5'-gatgttgggttgttgtccat-3’5’-ctctcgccgttcatgttcgt-3’5'-ggtcaggctcaggctgatgt-3’5'-atggtggatggcatgatgttg-3’5'-tgagcgaaaccctataagaaccc-3’内内源基因筛选检测筛选检测筛选检测筛选检测筛选检测鉴定检测鉴定检测鉴定检测鉴定检测鉴定检测任选其一任选其一任选其一品系表A.1(续)类别引物序列5'-ccttcgcaagaccctcctctata-3’5’-agatcatcaatccactcttgtggtg-3’5'-gtagctgtcggtgtagtcctcgt-3’5'-tactacatcgaccgcatcga-3’5'-cctaattcccttatctggga-3’5'-tctcgatctttggccttggta-3’5'-tgcagcccagcttatcgtcta-3’5'-acggtggaagagttcaatgtatg-3’5'-tctccttatgggctgca-3’5'-cttgtggtgtttgtggctct-3’5'-tggctcctccttcgtatgt-3’5'-gcactcaaagacctggcgaatga-3’5'-ccatctttgggaccactgtcg-3’5'-atgaatgacctcgagtaatcttgttaa-3’5'-aagagataacaggatccactcaaacact-3’5-gggaataagggcgacacgg-3’鉴定检测鉴定检测鉴定检测鉴定检测鉴定检测鉴定检测鉴定检测鉴定检测鉴定检测引物序列5’标记FAM;3'标记TAMRA或Eclipse适用范围(内源基因)5'-tgaacccatgcatgcagt-3’5’-ggcaagaccattggtga-3’任选其一(内源基因)5'-cgtcgtttcccatctcttcctcc-3’5'-aatcagggctcattctcgctcctca-3’5'-cgacagtggtcccaaaga-3’5'-aagacgtggttggaacgtcttc-3’5'-tggacccccacccacgaggagcatc-3’5'-atcgttcaaacatttggca-3’5'-attgcgggactctaatcata-3’5'-acaagcacggtcaacacc-3’5'-actcggccgtccagtcgta-3’5'-ccgagccgcaggaaccgcaggag-3’5'-gtcgacatgtctccggagag-3’5’-gcaaccaaccaagggtatc-3’5'-tggccgcggttgtgatatcgttaa-3’表A.2(续)引物序列5’标记FAM;3”标记TAMRA或Eclipse适用范围BTl1品系BT176品系TC1507品系NK603品系59122品系MIR604品系MIR162品系5’-gcacgaggaagcggtca-3’5'-cgcgactggatcaggtaca-3’5'-tggggaacaggctcacgat-3’5'-tgtgtggccatttatcatcga-3’5'-gacttcagcctgccggtact-3’5'-gtgcatcaatggaggagagaac-3’5'-cgttctgggaaggatagaatcgtc-3’5'-cttatcgttatgctatttgcaactttaga-3’5'-gatgccttctccctagtgttga-3’5'-ggatgcactcgttgatgtttg-3’5'-tgttacggcctaaatgctgaact-3’5'-ttctccatattgaccatcatactcatt-3’5'-cggtatctataataccgtggtttttaaa-3’5'-tagtcttcggccagaatgg-3’5'-ctttgccaagatcaagcg-3’5'-atgaatgacctcgagtaagcttgttaa-3’5'-aagagataacaggatccac5'-acaagcgtgtcgtgctccac-3’5’-cacacaggagattattatagggttactca-3’5'-acacggaaatgttgaatactcatactct-3’5'-gagcaggacctgcagaagct-3’5'-tccggagttgaccatcca-3’5'-gggataagcaagtaaaagcgctc-3’5'-ccttaattctccgctcatgatcag-3’5'-ggtcataacgtgactcccttaattct-3’5'-caccttcagcaacccgaacta-3’5'-cacccagccggccacagtcgat-3’5'-ccgccgcgagctgaccctgaccgtg-3’5'-ttccatgaccaaaatcccttaacgtgagt-3’5'-agataccaagcggccat5'-tggaacacccatccgaacaagtagggtca-3’5'-atccccggaaattatg5'-tggtaccacgcgacacacttccactc-3’5'-tcattgagtcgttccgccattgtcg-3’5'-aataaccctgataaatgcttca-3’5'-tcccgccttcagtttaaacagagtcgggt-3’5'-tttaaactgaaggcggg5'-aggcgggaaacgacaatctgatcatg-3’5'-gtcctcgtcgctgcccttcacct-3’品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定表A.2(续)引物序列5'标记FAM;3’标记TAMRA或Eclipse适用范围DBT418品系LY038品系3272品系DP98140品系5'-gtcatttcaggaccaggattcac-3’5'-cctctattctggatgttgttgcc-3’5'-tgggttcagtctgcgaatgtt-3’5'-aggaattcgatatcaagcttatcga-3’5'-tcatcagaccagattctcttatgg-3’5'-cgtttcccgccttcagtta-3’5'-ctctatcgatccccctctttga-3’5'-gactcccttaattctccgctca-3’5’-ggaggcgacttggttaggctgaattcttc-3’5'-cgagcggagtttatgggtcgacgg-3’5'-actgctgacgcggccaaacactg-3’5'-tcagattgtcgtttcccgccttcagt-3’品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系鉴定品系名称转入的外源基因启动子结构基因P-35不PSP-mt,UbiQNOS,NOS,NOS,NOS不详[1]Protocolforevent-specificquantitationofBtllinmaize,EU-CRL.[2]Foodstuffs-Methodsofanalysisforthedetectionofderivedproducts-qualitativenucleicacidbasedmethods,prENISO21570.[3]Event-specificmethodforthequantitati[4]Event-specificmethodforthequantitationofmaizelineMON863us[5]Event-specificMethodfortheQuantificationofMaize[6]Event-specificmethodforthequantitationofmaizeli[7]Event-specificmethodforthequan[8]Event-specificmethodforthequantitation[10]Event-specificmethodforthequantit[11]Event-specificmethodfo[12]Long,N.,Pulliam,D.,Bottoms,J.,Meghji,M.,Ha