荧光免疫试验

关于荧光免疫试验掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色与结果判断。熟悉：荧光物质。了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫技术的应用。教学目的第2页,共53页，星期六，2024年，5月第一节荧光免疫试验的组成因素第二节间接免疫荧光试验第三节流式荧光免疫试验第四节其他与荧光检测相关的免疫试验第五节荧光免疫试验的临床应用第六节影响荧光免疫试验的主要因素第3页,共53页，星期六，2024年，5月荧光免疫试验（fluoroimmunoassay):

以荧光物质标记抗体和抗原，通过与相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以此对待测物进行定位、定性和定量分析的检测技术，具有高度特异性、敏感性和直观性，是最早出现的免疫标记技术。第4页,共53页，星期六，2024年，5月

荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。第一节荧光免疫试验的组成要素吸收能量激发态

基态荧光效率第5页,共53页，星期六，2024年，5月荧光特点：

1可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；2一旦停止供能，荧光随之瞬间消失；第6页,共53页，星期六，2024年，5月(一)荧光的基本知识1.发射光谱:指固定激发光波长，在不同波长下记录到的标本发射荧光的谱图。2.激发光谱:指固定检测发射光波长，用不同波长的激发光照射标品得到的荧光的谱图。

一荧光及荧光物质基础知识第7页,共53页，星期六，2024年，5月荧光效率

＝吸收光的光量子数（激发光强度）发射荧光的光量子数（荧光强度）荧光色素本身的物理特性激发光强度及激发光波长决定于决定于3.荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率------荧光效率第8页,共53页，星期六，2024年，5月定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。

4.荧光寿命第9页,共53页，星期六，2024年，5月5.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。第10页,共53页，星期六，2024年，5月如何避免：勿长时间照射脉冲瞬间照射避光保存猝灭剂：具有荧光猝灭作用的物质荧光淬灭

第11页,共53页，星期六，2024年，5月荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定（二）荧光物质第12页,共53页，星期六，2024年，5月荧光显微镜

利用一定波长的激发光对待测标本进行激发，产生一定波长的荧光，对组织细胞结构或其组分进行定性、定位和半定量分析检测。

二、荧光显微镜第13页,共53页，星期六，2024年，5月隔热滤光片：位于灯室聚光器前，作用阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，作用能选择性地透过紫外线可见波长的光域，提供合适的激发光。

吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，作用阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。荧光显微镜滤光片第14页,共53页，星期六，2024年，5月透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)荧光显微镜光路第15页,共53页，星期六，2024年，5月第16页,共53页，星期六，2024年，5月第17页,共53页，星期六，2024年，5月1、抗体要求

高特异性高亲和力经纯化提取IgG

三、荧光素-抗体结合物第18页,共53页，星期六，2024年，5月有能与蛋白质形成共价健的化学基团荧光效率高，荧光色泽与背景组织的色泽对比度高。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。2荧光素要求第19页,共53页，星期六，2024年，5月一、基本原理特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。

间接荧光抗体染色法示意图

第二节间接免疫荧光试验第20页,共53页，星期六，2024年，5月间接免疫荧光法示意图第21页,共53页，星期六，2024年，5月第22页,共53页，星期六，2024年，5月间接法：

优点：敏感度高于直接法制备一种荧光抗体可检测多种抗原既可用于检测抗原，也可检测抗体缺点：易出现非特异性荧光方法较麻烦操作时间较长应用：自身抗体的检测第23页,共53页，星期六，2024年，5月标本片上滴加特异性抗体37℃30minPBS洗涤滴加二抗

37℃30minPBS洗涤镜检二、实验方法第24页,共53页，星期六，2024年，5月三、注意事项1.荧光染色时间：一小时内或2~8℃保存4小时，2.三种对照：①阳对：阳性血清+荧光标记物②阴对：阴性血清+荧光标记物③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物3.标本片需保持湿润，避免干燥4.滴加抗体或荧光标记物,始终保持在未知抗原标本上第25页,共53页，星期六，2024年，5月

-：无或仅见极微弱荧光。

+：荧光较弱但清楚可见。

++：荧光明亮。

+++：耀眼强荧光。特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈-或±。根据+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。

荧光抗体染色及结果判断第26页,共53页，星期六，2024年，5月第三节流式荧光免疫试验流式荧光免疫试验(flowcytometryandfluorescenceimmunoassay):采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行高通量分析的检测方法。悬浮阵列；流式微球阵列第27页,共53页，星期六，2024年，5月

第四节

其他与荧光检测相关的免疫试验第28页,共53页，星期六，2024年，5月其他荧光免疫试验时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定荧光偏振免疫测定第29页,共53页，星期六，2024年，5月自发荧光寿命短:1ns～10ns镧系元素寿命长:10μs～1000μs短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光（一）基本原理时间分辨检测原理示意图1.时间分辨一、时间分辨荧光免疫测定第30页,共53页，星期六，2024年，5月2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差。

stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠时间分辨荧光免疫测定第31页,共53页，星期六，2024年，5月发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高3.发射光谱和激发光谱时间分辨荧光免疫测定第32页,共53页，星期六，2024年，5月4.荧光标记物的相对比活性比活性：单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。Eu3+螯合物反复激发1000次/秒大大提高了荧光标记物比活性时间分辨荧光免疫测定第33页,共53页，星期六，2024年，5月结合β-二酮体Eu3+解离酸性增强液荧光增强Eu3+标记抗原抗体复合物5.信号增强时间分辨荧光免疫测定第34页,共53页，星期六，2024年，5月（二）标记物和标记方法时间分辨荧光免疫测定第35页,共53页，星期六，2024年，5月（三）方法类型

双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法时间分辨荧光免疫测定第36页,共53页，星期六，2024年，5月（三）方法类型时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图第37页,共53页，星期六，2024年，5月灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：4～5个数量级标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化易受污染，本底增高方法评价时间分辨荧光免疫测定第38页,共53页，星期六，2024年，5月光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。偏振荧光(绿光,525nm～550nm)偏振光(蓝光,485nm)荧光物质二、荧光偏振免疫测定第39页,共53页，星期六，2024年，5月

抗原抗体竞争反应AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱

AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比荧光偏振免疫测定原理示意图基本原理第40页,共53页，星期六，2024年，5月方法评价

样品用量少荧光素标记试剂稳定，使用寿命长重复性好快速，易自动化适于小、中等分子物质检测灵敏度较非均相荧光免疫测定法低荧光偏振免疫测定第41页,共53页，星期六，2024年，5月

第五节荧光免疫试验的临床应用

第42页,共53页，星期六，2024年，5月1.血清中自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)一、间接免疫荧光试验第43页,共53页，星期六，2024年，5月2.各种微生物的快速检查和鉴定寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)一、间接免疫荧光试验第44页,共53页，星期六，2024年，5月肿瘤（人肝癌细胞）间接免疫荧光试验3、寄生虫感染的诊断4、白细胞分化抗原的检测5、人类白细胞抗原的检测6、肿瘤组织中肿瘤标志物的检测7、激素和酶的组织定位第45页,共53页，星期六，2024年，5月（一）时间分辨荧光免疫试验二、其他荧光免疫试验1.内分泌学中的应用2.肿瘤学中的应用3.免疫学中的应用4.分子生物学的应用5.微生物学中的应用（二）荧光偏振免疫试验第46页,共53页，星期六，2024年，5月第六节、影响荧光免疫试验的主要因素一、荧光素-抗体结合物二、待检标本三、其他第47页,共53页，星期六，2024年，5月荧光素-抗体结合物的结合比率：

F/P=一、荧光素-抗体结合物抗体效价：双向免疫扩散试验抗体纯度：高亲和力、单克隆抗体抗体特异性：吸收试验、抑制试验第48页,共53页，星期六，2024年，5月荧光素与蛋白质结合的比率（F/P）------荧光素结合到抗体蛋白上的量是标记抗体质量鉴定的重要指标F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多第49页,共53页，星期六，2024年，5月组织标本：冷冻切片、石蜡切片和印片细胞标本：涂片