课题微生物的实验室培养

关于课题微生物的实验室培养放线菌第2页,共56页，星期六，2024年，5月真菌青霉菌第3页,共56页，星期六，2024年，5月黑曲霉酵母菌第4页,共56页，星期六，2024年，5月

微生物是一般肉眼看不见或看不清的微小生物，个体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物，统称为微生物。微生物包括细菌、病毒、真菌、和少数藻类等。（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）第5页,共56页，星期六，2024年，5月想一想这些肉眼看不到的微生物是怎样获得呢？第6页,共56页，星期六，2024年，5月课题1微生物的实验室培养专题2微生物的培养与应用第7页,共56页，星期六，2024年，5月你知道固体培养基的来历吗？为了能直接观察培养物的形态及生长情况，科学家希望能将微生物培养在固体表面上，就像微生物生长在橘子皮或土豆上一样。最初，德国医生罗伯特·科赫此试着用明胶作培养基的凝固剂。但是，人们很快发现，明胶在20℃以上就变软了，很难进行分离微生物的划线操作。而大多数细菌的培养温度都不低于25℃。科赫的同事WalterHesse发现琼脂比明胶更适合做培养基的凝固剂。这个改进的方法很快就被大家采纳。第8页,共56页，星期六，2024年，5月标准培养基类型配制特点主要应用物理性质固体培养基加入琼脂较多微生物的分离、计数等半固体培养基加入琼脂较少观察微生物运动、鉴定菌种、保藏菌种等液体培养基不加入琼脂工业生产，连续培养化学组成合成培养基由已知成分配制而成，培养基成分明确菌种分类、鉴定天然培养基由天然成分配制而成，培养基成分不明确工业生产目的用途鉴别培养基添加某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物选择培养基添加（或缺少）某种化学物质培养、分离出特定的微生物第9页,共56页，星期六，2024年，5月思考：1、固体和液体培养基的区别？固体培养基和液体培养基你认为哪个更适合工业生产？为什么？液体培养基；微生物与培养基中营养物质接触充分，快速生长繁殖和产生大量代谢产物第10页,共56页，星期六，2024年，5月选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物加入四环素、卡那霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞可抑制细菌、放线菌细胞壁主要成分肽聚糖的合成其细胞壁是由纤维素、几丁质、葡聚糖组成第11页,共56页，星期六，2024年，5月牛肉膏（BeefExtract）又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。现在，市场上出现了一些熟食店、面馆为牟利而用牛肉膏将猪肉“变”牛肉的现象第12页,共56页，星期六，2024年，5月蛋白胨从来源上可分为动物性蛋白胨和植物性蛋白胨。胰胨、肉胨、骨胨等都是动物性蛋白胨，而大豆蛋白胨等则是植物性蛋白胨。动物性来源的蛋白胨还有：蚕蛹蛋白胨、血液蛋白胨等。蛋白质分解产物，如将牛肉、酪蛋白、牛奶粉、白明胶、大豆蛋白、丝蛋血纤维蛋白等为原料，经不完全的水解工艺所得的产物。市售产品以淡黄至棕黄色粉剂为主。其分子量介于月示和肽之间，约2000左右。不同来源的蛋白质和不同的水解条件，其水解物中组成可千差万别。所以胨往往是一个复杂的多肽混合物。可溶于水，过热不凝固，在饱和硫酸铵中不发生沉淀但可为蛋白质沉淀剂所沉淀。可用作微生物和动物细胞培养基、特种功能性食品和化妆品的配料，也有用作啤酒等产品的稳定剂。鲜骨蛋白胨采用新鲜骨为原料，经发酵喷雾干燥而成。广泛用于黄原胶、食品添加剂、医药中间体、生物制品等发酵产品中第13页,共56页，星期六，2024年，5月菌落:单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。第14页,共56页，星期六，2024年，5月观察菌落特征。如：粗糙与光滑程度2、记得不用显微镜如何区分S型细菌和R型细菌吗？第15页,共56页，星期六，2024年，5月二、无菌技术1、什么是无菌技术无菌技术泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。第16页,共56页，星期六，2024年，5月[思维激活]

用酒精擦拭实验者手臂属消毒还是灭菌？70%与95%的酒精，哪一种效果更好？为什么？

提示酒精擦拭属化学消毒，酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好。原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。消毒和灭菌的区别条件结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌第17页,共56页，星期六，2024年，5月芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌孢子细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。能直接发育成新个体。第18页,共56页，星期六，2024年，5月第19页,共56页，星期六，2024年，5月比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒灭菌较为温和强烈部分生活状态的微生物不能全部微生物能第20页,共56页，星期六，2024年，5月1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法第21页,共56页，星期六，2024年，5月1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.(2)灭菌的方法：第22页,共56页，星期六，2024年，5月三、实验安排本实验采用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌的纯化培养，实验过程分为两个阶段：1、制备培养基2、纯化大肠杆菌大肠杆菌第23页,共56页，星期六，2024年，5月1、制备培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL（1）计算根据下列培养基配方比例，计算配置100mL培养基时，各成分的用量。第24页,共56页，星期六，2024年，5月（2）称量注意

牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖。蛋白胨牛肉膏用玻璃棒挑取牛肉膏第25页,共56页，星期六，2024年，5月（3）溶化①加水加热熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。第26页,共56页，星期六，2024年，5月（5）灭菌在压力为100kPa，温度为121℃条件下，灭菌15-30min。（6）倒平板（4）调节PH第27页,共56页，星期六，2024年，5月倒平板技术第28页,共56页，星期六，2024年，5月答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？第29页,共56页，星期六，2024年，5月2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既防止皿盖上的水珠落入培养基,又可以避免培养基中的水分过快地挥发。第30页,共56页，星期六，2024年，5月4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。第31页,共56页，星期六，2024年，5月（二）纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法①平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面.在数次划线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.第32页,共56页，星期六，2024年，5月平板划线操作1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红2.在火焰旁冷却接种环、并打开棉塞第33页,共56页，星期六，2024年，5月3.将试管口通过火焰。5.将试管口通过火焰，并塞上棉花。4.将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。第34页,共56页，星期六，2024年，5月一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。6.左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。第35页,共56页，星期六，2024年，5月8.将平板倒置，放入培养箱中培养。7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作。在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区域的划线与第一区域相连。第36页,共56页，星期六，2024年，5月1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养划线分离法注意事项:其他画线分离图：第37页,共56页，星期六，2024年，5月不同的平板划线法第38页,共56页，星期六，2024年，5月培养基表面的单菌落第39页,共56页，星期六，2024年，5月1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。讨论：第40页,共56页，星期六，2024年，5月2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第41页,共56页，星期六，2024年，5月6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：菌液微量移液器第42页,共56页，星期六，2024年，5月⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：b.涂布平板：不超过0.1ml各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照滴灼冷涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍第43页,共56页，星期六，2024年，5月第44页,共56页，星期六，2024年，5月稀释涂布法第45页,共56页，星期六，2024年，5月涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？答：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等。讨论第46页,共56页，星期六，2024年，5月结果分析与评价

培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录第47页,共56页，星期六，2024年，5月微生物的培养基础知识实验操作结果分析与评价培养基定义：分类：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养物质固体培养基液体培养基无菌技术培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法定义：消毒与灭菌常用灭菌方法制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌(平板划线法和稀释涂布平板法）课堂小结第48页,共56页，星期六，2024年，5月1.干燥、真空包装、冷藏冷冻等。这些方法抑制微生物生长需要的水、空气、适宜的温度等来阻止其生长。2.这三种培养技术都需要为培养物提供充足的营养，但无土栽培技术的操作并不需要保证无菌的条件，而其他两种技术都要求严格的无菌条件。习题答案第49页,共56页，星期六，2024年，5月3.正是由于证明了微生物不是自发产生的，微生物学才可能发展成为一门自立的学科；巴斯德实验中用到的加热灭菌的方法到这了有效的灭菌方法的出现，而这一灭菌原理也适用于食品的保存。第50页,共56页，星期六，2024年，5月【例1】

培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是 ()。 ①化学消毒②灼烧灭菌③干热灭菌④紫外线灭菌⑤高压蒸汽灭菌⑥巴氏消毒法 A．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥ C．⑥②③④①⑤ D．③④②①⑥⑤深度剖析培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿能耐高温，需用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；牛奶为不破坏其营养成分可采用巴氏消毒法。答案A第51页,共56页，星期六，2024年，5月[例3]

除平板划线法与稀释涂布平板法外，还有哪些接种方法？微生物接种技术中最核心的内容是什么？提示微生物接种方法还有斜面接种及穿刺接种等方法，所有微生物接种方法中最核心的内容是“防止杂菌污染，保证培养物的纯度”。第52页,共56页，星期六，2024年，5月【例4】

下列有关平板划线操作的叙述不正确的是 ()。 A．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种 C．在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液 D．划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者第53页,共56页，星期六，2024年，5月解析平板划线操作中，接种环取菌种前灼烧的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养物，以后每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线后残留的菌种。划线结束