出口动物饲料中己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚的检测方法

出口动物饲料中己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚的检测方法本标准规定了动物饲料中人工合成激素己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚的检测方法本标准适用于动物伺料中己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚的检测。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备第一法气相色谱-质谱法3方法提要动物饲料中己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚经乙酸铵缓冲溶液均质后，用乙醚提取，提取液经固相萃取柱净化、洗脱、液缩、行生化后，由气相色谱-质谱(GC-MS)的选择离子模式测定，外标4.3氢氧化钠4.5冰乙酸。4.7乙醇，色谱级4.9叔丁基甲醚，色谱级。4.111.0molL氢氧化钠溶液：称取40.0g氢氧化钠(43),用水溶解并定容至1L4.120.1molL氢氧化钠甲醇溶液：称取4.0g氢氧化钠(43),用甲醇(4.1)溶解并定容至1L4.130.2moVL乙酸铵缓冲溶液(pH5.2±pH0.2):称取15.4g乙酸铵(4.4)溶解于900mL水中，用冰乙酸(4.5)调节pH值至5.2±0.2,用水定容至1L。4.14淋洗液：量取70mL0.1mol/L氢氧化钠甲酶溶液(4.12)和30mL水，充分混合。4.15洗脱液：量取90mL叔丁基甲醚(4.9)加10mL甲醇(4.1)配成混合溶液，再加2mL甲酸(4.8),充分混合4.16衍生化溶液：N-O-双-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氧硅烷(TMCS)(99+1)。在避光、防潮环境下冷冻储藏4.17己烷雌酚标准品；纯度大于等于98烧，CAS号为84-16-2,分子式为C₂H₂O₂,相对分子质量为4.18己烯雌酚标准品：纯度大于等于99%,CAS号为56-53-1,分子式为CH₂O₂,相对分子质量为4.19双烯雌酚标准品：纯度大于等于98%,CAS号为84-17-3,分子式为C₂H₂O₂,相对分子质量为4.20标准储备液(1.0mg/mL):分别精确称取25.0mg己烷雌酚标准品(4.17)、己烯雌酚标准品(4.18)、双烯雌酚标准品(4.19)于25mL容量瓶中。用乙醇(4.7)定容。配成1.0mg/mL的标准储备液，于-18℃冰箱内避光保存，有效期为1年。根据需要再用乙醇将标准储备液稀释成适当浓度的标准工作溶液。4.21固相萃取柱：苯乙烯-二乙烯苯共聚物基质的混合型阴离子交换柱(MAX.60mg。3mL),或者相当者，使用前依次用5mL甲醇(4.1)、5mL水淋洗，流速2mLmin5仪器和设备5.1气相色谱-质谱仪：四极杆质谱仪，配有E源并具有选择离子功能。5.2电子分析天平：感量00001g、001g。5.3离心机：最大转速为5000-min。5.4螺旋盖聚丙烯离心管：15ml、50ml5.6氮吹浓缩仪。5.7恒温箱。5.8固相萃取装置。5.10移液器：10μL~100μL,100μL~1000pL,1mL~5mL。5.11高速振荡机。6.2按照GB/T20195的规定制备试样。在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生含量的变化。7测定步骤称取50g(精确至0.01g)动物饲料于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL0.2moVL的乙酸铵缓冲溶液(4.13),均质1min。加入10mL乙醚(4.2),振荡提取3min,于3500r/min离心5min,吸取乙醚层于另一试管中。重复乙醚提取一次，合并的乙醚相在常温下用氮气吹干。加入2mL三氯3甲烷(4.6)溶解残余物。旋涡振荡1min,加入5mL1.0mol/L氢氧化钠溶液(4.11)。振荡1min,于1500r/min离心3min,上层水相移人另一试管中。重复氢氧化钠溶液提取一次，合并氢氧化钠溶液合并的氢氧化钠溶液过固相萃取柱(4.21),流速2mL/min,依次用5mL1.0mol/L氢氧化钠溶液(4.11)和5mL0.1molL氢氧化钠甲醇溶液+水溶液(4.14)淋洗固相萃取柱，待溶液流过固相萃取柱后，在65kPa的负压下，减压抽干。加人5mL叔丁基甲醚+甲醇溶液(4.15)洗脱，控制流速在低于40℃下，用缓和缸气流将洗脱液吹至约1mL,移人反应瓶中。加入0.5mL叔丁基甲醚+甲醉溶液(4.15)洗涤一次。并人反应瓶中。在40℃下用氮气吹干，加入100pLN-O-双-(三甲基硅基)三氟乙酰胺+三甲基氧硅烷析生化溶液(4.16),加盖密闭后于旋涡混合器上混匀。在70℃的烘箱中加热1h。放置冷却后开盖用氮气次干多余的溶剂。加入0.2mL异辛烷(4.10)溶解残渣，供7.4.1气相色谱条件气相色谱条件如下：a)色谱柱：弹性石英毛细管柱，HP-5MS30mx0.25mm(内径),膜厚0.25μm或相当者b)载气：高纯氮(纯度99999%),流量：1.0ml/mm230℃(保持2min)。再以30℃/min升温至300℃(保特1min)。d)进样口温度：250℃。e)接口温度：280℃。f)进样模式：无分流方式，0.75min打开分流阀。7.4.2质谱条件质谱条件如下：a)离子源温度：250℃;四极杆温度：100cc)EM电压：高于调谐电压200V。d)溶剂延迟时间：12min。——己烷雌酚：207,179,191,399。——己烯雌酚：412,383,397,413。——双烯雌酚；410,381,395.411。7.4.3定量测定根据样液中被测己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。其响应值均应在仪器检测的线性范围内。以单点或多点外标法定量。标准工作溶液和样液应等体积参插进样测定。 第二法液相色谱-质谱/质谱法动物饲料中己烷雌酚、已烯雌酚、双烯雌酚经乙酸铵缓冲溶液均质后，用乙醚提取，提取液经固相萃取柱净化、洗脱、浓缩后，由液相色谱-质谱/质谱仪(LC-MS/MS)测定，内标法定量。除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水12.5已烯雌酚-48标准品：纯度大于等于98%,CAS号为91318-10-4,分子式为C₀H₂D.O₂,相对分12.6标准储备液(0.1mg/mL):分别精确称取1.0mg己烷雌酚标准品(4.17)、己烯雌酚标准品(4.18)、双烯雌酚标准品(4.19)标准品于10mL容量瓶中，用甲醇(4.1)定容，配成0.1mglmL的标准储备液，于-18℃冰箱内避光保存，有效期为1年。12.7内标储备液(0.1mglmL):精确称取1.0mg己烯雌酚-18标准品(12.5)于10mL容量瓶中，用甲12.8混合标准中间液(100ngmL):分别精确移取10μL己烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚标准储备液(12.6)混合于10mL容量瓶中，用甲醇(4.1)定容，配成100ng/mL的混合标准中间液，于4℃冰箱内避光保存。有效期为6个月。12.9内标中间液(200ng/mL):精确移取20L内标储备液(12.7)于10mL容量瓶中，用甲醇(4.1)定容，配成200ng/mL的内标中间液，于4℃冰箱内12.10乙腈-水溶液(50450.体积比):量取乙腈(12.1)50mL和水50mL,混合均匀12.11乙腈饱和的正己烷溶液：量取正己烷(12.2)200mL于250mL分液漏斗中，加入少量乙腈(12.1),刷烈振摇数分钟，静止分层后弃下层乙腈层即得12.12混合标准工作液：根据需要用乙腈-水溶液(12.10)将混合标准中间液(12.8)配制适当浓度为0ngmL、25ngmL、5ngmL、10ng/132电子分析天平：感量00001g、0.01g。13.3离心机：最大转速为15000yhmin。13.7固相萃取装置13.9移液器：10μL~100μL,10613.10高速速振荡机。13.11连盖聚丙烯离心管：2mL。14.1按照GB/T14699.1的规定采样。14.2按照GB/T20195的规定制备试样，在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生含量的变化。称取5.0g(精确至0.01g)动物饲料于50mL具塞塑料离心管中，准确加入25μL内标中间液(12.9)和10mL0.2mol/L的乙酸饮缓冲溶液(4-3),涡旋30s。加人10mL乙醚(4.2),涡旋30s,加入5.0g无水氧化钠(123)。涡旋30s,振荡提取5于4500rhmim离心5min,吸取乙醚层于另一试管中。乙醚重复提取一次，合井的乙湖相在常温下用氮气吹至近干。加入2mL三氯甲烷(4.6)溶解残余物，涡旋1min,加入5mL10mol/L氢氧化钠溶液(4.11),涡旋Imin,于4500r/min离心3min,上层水相移入另一试管中，氮氧化钠溶液重复提取次。合并氢氧化钠溶液提取液。合并的氢氧化纳提取液过固相萃取柱(4.21)。流速2ml/min依次用5mL1.0mol/L氢氧化钠溶液(4.11)和5mL0.1mol/L氢氧化钠甲醇+水溶液(4.14)淋洗固相萃取柱，待溶液流过固相萃取柱后，在65kPa的负压下，减压抽干。加入5mL叔丁基甲醚+甲醇溶液(4.15)洗脱，控制流速在2mL/min.收集洗脱液。低于40℃下。用级和氮气流将洗脱液吹至近干。加入1mL乙腈-水溶液(12.10)溶解残渣，加入1mL乙腈饱和正己烷溶液(12.11),涡旋混匀30s,转移至2mL连盖塑料离心管中，于4℃15000bhmin离心3min,将下层溶液过022μm滤膜(1213)。滤液供液相-质谱/质谱仪测15.3.1液相色谱条件液相色谱条件如下：b)流动相：A,含0.25%氨水的水溶液；B,乙腈溶液c)流速：0.30mL/min。d)柱温：35℃。e)进样量：10μL。f)梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序7表1(续)X——试样中己烷雌酚、已烯雌酚、双烯雌酚的含量，单位为微克每千克(μg/kg);c——己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚响应值在标准曲线上计算得到的浓度，单位为微克每升 样品定容体积，单位为豪升(mL)m——样品称样量，单位为克(g);1000/1000——换算系数。18定量限和回收率18.1定量限本方法的定量限如下：己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚均为1.0pg/kg。动物饲料中己烷雌酚、已烯雌酚、双学唯酚添加浓度及其回收率数据参见附录F表F.1。(资料性附录)选择离子色谱图选择离子色谱图见图A.I。24(资料性附录)选择离子监测程序表表C.1选择离子监测程序表目标化合物(资料性附录)API6500型质谱/质谱仪参考质谱条件1参考质谱条件a)离子源：电喷雾离子源，负离子模式；b)检测方式：多反应监测(MRM);f)辅助气流速度(GS2):0.414MPa;i)其他质谱参数见表D.1。表D.1激素药物及其内标物的主要参考质谱参数而而……m,1(资料性附录)添加回收率试验数据表F.1己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚含量测定的添加回收率试验数据回收率范围%75.5~99.DeterminationofhexestrSetaMAXcartridgo(4.21)omasolid-phaseextractionapparatus.Conditionmethanoland5mLwaterat2mL/min.Loadthesodiumhydrosideestractintocartridgewith5mLofImolLsodiumhydroxidesolution(4.11)andthen5mLof0.1mol/Lsodiuminmethamol-water(4.14).Pungethecantridgebyairtoremovenesidualrinsingsoluwith5mLoffommieacidint-methylbutylether-methanol(4.15)at2ml/min.CollettheelateEvaporatetheelutetonearlydgnsst40Tummdleragratlestreamofnitrogen,theintoaderivatizationvialandevaporatetodrynessat40℃.Addtemperature,coverthecapandeafonitethesnhtinydpynessundernatrm200pLofisooclane(4.10)forthedeterminationbySCAMs.7.4.1GCoperatinga)ColummeHP-5MS,30m×0.25mm(i.d)×0.25μm(filmthickness),orb)Cariergas:Helium,purity99.999%,Colummttohitetmtmm.e)Colunnlemperalurepngramme:150℃to230℃,holdfor2min,rypatd)Injpectiontemperatf)Injectormode:Splidless.pungapr0.75mig)Injectionwolume:1pa)Ionsouretemperature:250cdopoleb)lonizationmodeElectoc)Electricity:Overthetuningelertricity,200d)Solventdelay:1——hexestml:207,179,191,399.——diethylstilbestrol:412,383,397,41—dienestrol:410,381,395.4117.4.3QuantitationdetAcecordinglotheapproximateeoncentrationofhexestml,diethylstilbestrolanddienestsolutiom,seletthestandandworkingaolutionwithsimilarpeakameatothofboththestandandworkingsolutionsandsamplesolutionsshouldbeinthelinearrdeteetion.Thestandarndworkingsolutionshouldberandomlyinjecledinbetweentheinjeetion—5pg/kg,thereroweryis91.8%—15pg/kg,therecoveryis90.3%Fortifyingconcentationofdienestrolanditscomespo μg/kg,thereeoveryis79——5pg/kg,therecoveryis91.5%—15pg/kg,thereoweryHesestrol,diethylstilhestrolanddienestrolinsamplearehomogenisedwithammoniumthenestractedwithdiethylether.Theestactiscleanslapoasolid-phiseestractioncacompoundsaredetenminedhyLC-MS/MSandnuantifiedbyinternodstandandUnlesothensisespecified,allreagentsshouldbeofanalyticalgrale,“Water”isthe12.1Acelonitrile,HPL12.4Ammoniumhydmxi12.5Diethylstilbestrol-d8:panY8-cASNo.91318-10-4.stmcturalformula:C₂H₂D₂O.molecularweight:27640.12.6Stockstandandsolution(0.1mg/mL):Weight1.0mghexesdienestrol(4.19),dissolveinmethanolandconstantwolunein10ml.volumetriefloskbyconcentationof0.1mghmLThestocksandanlsolutionstore12.7Intemalstockstandardsolution(0.1mg/mL):Weight1.0mgmethanolandconstantyolumein10mLvwolumetrieflaskbymethanol(4.1)iofinstockstandandsolationstoreinnfigratedat-18℃in12.8Mixadslandandsolutions(100ng/mL):Renove10μLsiflaskdilateandcomstantyolumebymethanoltofinalconcentationof100ng/nfigratodat4℃inbown12.9Workingintemalstandandsolatioms(200ng/mL):Hemove20pLintenalsin10mLwlumeticelakdilteandconstantwolumehymcthanoltofinalconrentatsohutionstoreinrefigernatedat4℃inbomnbotlefor12.10Acetonitile-watersohution(50+50,wh):Remove50mLocetonitle(12.1)and5012.11Acetonitrile-siturated-hesxanesohtion:Hemowe200mLhexane(12.2)in250mLseparatoracctonitile(12.1),osrillatedfewminutes,12.12Calibeationcureslandandworkingsolution:Thesolutionswere(12.10).ThecanwentationisOnghmL,2.5ng/mL,5ng/mL,10nghmL,50ng/mL,containint12.13Milijoreflicer:0.22jμm.13.1Highpeformancehiquidchomatography-tandemquadnipolemussspectrometryorequivalent:13.2Analyticalbalancessensitisity:0.0001gan13.4Polypopylenecentrfuge13.6Nitmgngiahosiogo13.9Ppele10μL～113.11Polypopylenecntifugt14.2PreparationofletsamplesacondingioGB/T20195.InthecourseofsamplingaprecationshouldbetakentoawoidontaminationoranyfactorthatmaycausesthechangeAcecuratelyweigh5.0g(accurateto0.01g)amimalfeadintoa50mLcentifuggtubadd25μLintemalstandanlworkingsolution(12.9)and10mL0.2molLVortexfor30s,thenadd10mLdethylether(4.2),yortexfor30s,adwortexfor30s,andoscillte5minadooatrifongofot5minlayerintoanothercleantube.Repeatestnuctiononce.Combinetheundernitogen.Dissolvetheresiduewith2mLchlomfhydosidesolution(4.11),votexfImiaiadeeatrifyofor3minat4500r/min.Transfertheupplayertoanothercleantube.RepeatestrictiononcgandcombinetheextractofsodiumSetacartridgonasolid-phaeestruetionapantus(4.21).Condionthand5mLwaterat2ml/min.Loadthesodiumhydroxideextractimtothe5mLof1mol/Lsondiumhydroxidesolatian(4.11)andthen5mLof0.1nolVLsodiumhydmwater(4.14).Purgethecartridpebyairtoremovenesiduulnnsingsolution.Elatethecartridgewithformicacidint-methylbutylether-methunl(4.15)ay2mL/min.Calettheeluteintoanothercleanvaporatetodrynessundernitogen.DisolethensiduewithImLaatomirile-1mLscetonitrle-saturated-heaneslution(12.11),vortesfor30sThansferthetubewithscnewcapandcentrfugefor3minat1500tmir(4t).Th0.22pμmfilm(12.13)anddetema)ColummCgchmmatographycohopmpaticlsdiamer,150mm×2.1mm(id),orequivaleb)MobilephaeseA,Water,contaim0.25%amaonia,B.Acetonitrilec)Fowrnate0.3mLd)Columntempernture)Injectianwolume:10f)GadientehutionprocedureTable