DB6521T 074-2024 SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度技术规程

ICS65.020.01CCSB21

6521吐 鲁 番 市 地 方 标 准DB6521/T074—2024SSRTechnicalspecificationforpurityidentificationofmelon bySSRmarkermethod2024-05-17发布 2024-06-17实施吐鲁番市市场监督管理局  发布DB6521/T074DB6521/T074—2024II前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所提出。本文件由吐鲁番市农业农村局归口。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所。对本文件的修改意见、建议，请反馈至新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所（鄯善县苗园路4号）、吐鲁番市市场监督管理局（吐鲁番市高昌区西环北路2712号）。（鄯善县苗园路4号。（吐鲁番市高昌区西环北路2712号（传真邮编：838000。DB6521/T074DB6521/T074—2024PAGEPAGE1SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度技术规程范围本文件规定了甜瓜品种纯度SSR（simplesequencerepeat，SSR）分子标记鉴定的原理、仪器设备和PCR反应相关试剂、方法步骤和纯度计算的要求。本文件适用于甜瓜杂交种纯度鉴定。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T3543.1农作物种子检验规程总则GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。purityofvariety指品种在特征方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检作物种子数的百分率表示。simplesequencerepeat(SSR)（1～6个100～200）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。polymerasechainreaction(PCR)利用DNA在体外95℃高温变性成单链，低温（通常是55℃～60℃）时引物与单链按碱基互补配对DNA（5´～3´）的方向合成互补链。primer人工合成的两段寡核酸序列。一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。原理品种的不同本质上是由于其遗传物质DNASSR广泛分布于甜瓜整个基因组中，PCRPCR仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。溶液配制溶液配制方法见附录B。引物引物相关信息见附录C。操作程序样品准备取200粒种子，催芽。DNA提取总则DNA提取方法应保证提取的DNA质量符合PCR扩增的要求，DNA溶解液的紫外光吸光度OD260与OD280的比值应介于1.8～2.0之间。DNA提取可任选8.2.2与8.2.3CTABCTABDNA：2.0mL离心管，液氮冷冻后，迅速研磨成粉末；800μL2%3010min5～10次；800μL24∶1200次；8,000rpm10min，抽取上清液到一个新的离心管中；2/3体积的异丙醇，上下颠倒200次，混匀；12,000rpm10minDNA成白色团装聚于管底，弃去上清；75%2次，最后一次用移液枪吸干管底的多余酒精，然后放置在超净台中吹干水分；50μLRNaseddH2ODNA4ºC备用。DNA将种子嫩芽取下，装入2mL离心管，同时放2颗小钢珠；；加100μLNaOH（0.1mol/L）溶液，用高通量组织研磨器打碎样品；然后将离心管置于沸水中1min，冷却后加入100μLTris（100mmol/L，pH注：嫩叶DNA提取用CTAB法；种芽DNA提取采用碱裂解法。PCR扩增反应体系PCR反应体系（共20μl）：6.4μLddH2O；10μLMixforPAGE；0.6μL上下游混合引物（10μmol/L）；3μL模板DNA。反应程序945min；9430s，55～6015s，7215s，36个循环；724min；4℃保存。PCR产物检测SSR-PCR8%SSR-PCR扩增片段用银染法染色。凝胶制备蘸取洗洁精用清水将玻璃板反复擦洗干净，再用去离子水冲洗后晾干；将前后两块玻璃板用铁夹8%0.5%10%0.1%体积的TEMED，充分混匀后，立即灌胶至玻璃胶室，灌胶过程防止气泡产生。灌满胶后，及时将样品梳插入其中，待胶凝固后使用。电泳待凝胶凝固后，将玻璃板用铁夹固定到电泳槽上，加入0.5×TBE电泳缓冲液，中间的液面应没过1，2～5μLPCR150500mA，1h左右（指示剂到达胶板中下部即可）停止电泳，关闭电源。染色6min；0.2%12（或去离子水3030s注：固定液、染色液，去离子水和显影液的用量，可依据胶板数量进行调整，以没过胶面为准。SSR扩增图谱的判读SSR图谱进行数据记录时，采用每对引物在不同品种中扩增的整体带型为单位进行数据记200个单株整体带型差SSRSSRPCR扩增产物谱带具有双亲的条带。甜瓜杂交种纯度计算SSRC=T−N×100% （1）T式中：C——品种纯度，单位为%；T——供检样品总数，单位为个；N——非本品种供检样品数，单位为个。记录与档案应对整个试验过程进行详实记录，记录档案至少保存两年，做到可追溯。附 录 A（规范性附录）主要仪器设备水浴锅PCR仪电泳仪垂直电泳槽及配套的制胶附件高速冷冻离心机水平摇床电子天平制冰机磁力搅拌器冰箱紫外分光光度计高通量组织研磨仪通风橱微波炉凝胶成像仪pH计移液枪胶片观察灯主要试剂无水乙醇三氯甲烷氢氧化钠丙烯酰胺过硫酸铵（APS）冰醋酸硝酸银琼脂糖MixforPAGE去离子水ddH2O十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）异丙醇甲叉丙烯酰胺硫代硫酸钠（Na2S2O3）甲醛四甲基二乙胺（TEMED）DNAMarker异戊醇氯化钠Tris碱40%Acr-BisTris-HCl附 录 B（规范性附录）溶液配制DNA提取0.5mol/LEDTA溶液称取18.61gNa2EDTA•H2O，溶解于70mLddH2O中，定容至100mL，pH调至8.0，高温灭菌。1mol/LTris-HCl溶液称取12.1gTris碱溶解于80mlddH2O中，ddH2O定容至100mL，调节pH至8.0。CTAB提取液称取4.0gCTAB16.364gNaCl20mL的1mol/L8mL的0.5mol/LEDTA、70mL的ddH2O震荡摇匀，定容至200mL，高温高压灭菌30min，冷却后置于阴凉干燥处备用。0.1mol/LNaOH2gNaOH，加ddH2O定容至500mL。0.1mol/LTris缓冲液12.1gTris，加ddH2O定容至1000mL，调节pH至8.0。PCR扩增MixforPAGE成品（MixforPAGE）。用ddH2O20μmol/L电泳B.3.150×TAE（500mL）121gTrisNa2EDTA•H2O18.6g或0.5mol/L400mL28.55mL冰乙酸，调pH=8.3，定容至500mL。B.3.210×TBE（1000mL）108gTris、55g硼酸、37.25mLEDTANa2，ddH2O定容至1000mL。40%Acr-Bis丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺按质量比19:1配制。TEMED成品（四甲基二乙胺）。10%APS20g过硫酸铵加ddH2O定容至200mL（400μL分装，～20℃保存）。聚丙烯酰胺凝胶（mLddH2O4mL10×TBE8mL40Acr-Bis40μLTEMED、400μL10APS。染色固定液50mL无水乙醇、2.5mL冰醋酸，加ddH2O至500mL。染色液1gAgNO3，加ddH2O至500mL。清洗液120μL10%Na2S2O3，加ddH2O至500mL。显影液7.5gNaOH、1.5mL甲醛，加ddH2O至500mL。附 录 C（规范性附录）核心引物表C.1核心引物序号名称正向引物(5′-3′)反向引物(5′-3′)1SSR12083GAATTGGCCCATCCTTCATTGCCATTCCAAAAACTTTTCAAC2MU5554-1CCTTCATGATCCTCTACTAAACCCTCTTCCATGCTTTTCTCGCT3TJ10ACGAGGAAAACGCAAAATCATGAACGTGGACGACATTTTT4PM3TCAACTGTCCATTTCTCGCTGCCGTAAAGACGAAAACCCTTC5MU5499AAGAAGAAAGTTCCCCTCTCGCGACTGTGTCTTGTGGAGGA6