生物学多糖提取纯化以及结构解析

2012.10.31糖类介绍多糖提取多糖纯化多糖结构分析2012.10.31糖类介绍多糖提取多糖纯化多糖结构分析糖类介绍2012.10.31糖类(Carbohydrates)物质是含多羟醛或多羟酮类化合物。主要由C、H、O组成，其分子式常用Cn(H2O)n来表示。定义：多羟基醛；多羟基酮；多羟基醛或多羟基酮的衍生物。2012.10.31ContentwelcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience糖类广泛分布于生物体中，可以分为单糖、低聚糖和多糖。目前已发现不少糖类及其衍生物具有药用价值，尤其在抗凝、降血脂、提高机体免疫和抗肿瘤、抗辐射方面都具有很广泛的应用。糖类分布2012.10.31糖的分类衍生糖复合糖多糖寡糖单糖凡不能被水解为更小分子的糖称。如：核糖、葡萄糖凡能被水解成少数（2—10个）单糖分子的糖称~。如：蔗糖葡萄糖+果糖

凡能被水解成多个单糖分子的糖称~。如：淀粉n葡萄糖与非糖物质结合的糖。如：糖脂、糖蛋白(蛋白聚糖)、糖核苷酸等。糖的衍生物。如：糖醇、糖酸、糖胺、糖苷等

2012.10.31糖类介绍多糖提取多糖纯化多糖结构分析多糖提取2012.10.31单糖、低聚糖常用水或醇提取，然后用不同的有机溶剂萃取得到不同极性的化合物。多糖常用热水、稀碱或稀酸溶液进行提取。（植物体内苷常与水解酶共存，所以要杀酶或抑制酶的活性。）脱脂→去杂→浓缩→再次去杂→脱色→浓缩→冷却→结晶（→进一步纯化）2012.10.31多糖提取粗多糖热水提稀碱提微波提取超临界流体萃取超声提取物理辅助提取2012.10.31热水提取稀碱提取适合用此方法的多糖主要是不溶性胶类，用冷水浸润红0.5mol/LNaOH提取，提取液用酸中和后浓缩，再加乙醇沉淀即得到多糖。甘露聚糖、半乳糖等利用此法可得到相当纯的物质。对于易溶于温水、难溶于冷水和乙醇的多糖采用这种方法。材料需要先用冷水浸过，再用热水提取，必要时可加热至80～90℃，搅拌提取，提取液用正丁醇与氯仿混合液除去杂蛋白，离心除去杂蛋白的清液，透析后用乙醇沉淀即得到多糖。2012.10.31除杂Sevag法(用氯仿:丁醇5:1混合)三氟三氯乙烷法(多糖溶液:三氟三氯乙烷1:1)三氯乙酸法(滴加3%三氯醋酸)酶法等电点沉淀法2012.10.31糖类介绍多糖提取多糖纯化多糖结构分析多糖纯化2012.10.31纯化方法由于提取液还含有多种组分的多糖混合物，因此需要进一步纯化（1）沉淀法（分级沉淀）（2）盐析法（3）季铵盐沉淀法（4）纤维素柱色谱法（吸附+分配）（5）离子交换色谱法（6）凝胶柱色谱法（7）制备区域电泳法（8）金属配合物法2012.10.31由于不同相对分子质量的多糖在不同浓度的低级醇或低级酮中溶解性不同，可以逐步提高溶液中醇或酮的浓度以使不同组分的多糖依相对分子质量由大到小的顺序沉淀，最终达到分离的目的。沉淀原理（为了多糖的稳定，一般在PH7时进行，酸性多糖在PH2-4时进行)2012.10.31利用不同多糖与金属离子成盐后在水溶液中的特异性沉淀作用，用硫酸铵、乙酸钾、氯化钾等盐析剂，将不同的多糖逐步析出。盐析法原理原理金属配合物法原理：利用不同多糖能与金属离子形成配合物而沉淀下来，使用多种配位剂沉淀多糖。2012.10.31长链季铵盐是碱性表面活性剂，酸性多糖在溶液中以聚阴离子形式存在，它就与季铵盐或其碱形成不溶性配合物沉淀，又由于多糖分子酸性越强、相对分子质量越大越易沉淀出来，这样控制季铵盐浓度即可以分理出不同的酸性多糖季铵盐沉淀原理与酸性多糖形成不溶性沉淀，使其分离。常用季氨盐有十六烷基三甲胺溴化物及其氢氧化物和十六烷基吡啶。提高溶液PH值或加入硼砂缓冲液，也可沉淀分离中性多糖。2012.10.31它利用的是不同多糖浓度乙醇中溶解性不同，先用4倍V的乙醇将多糖混合液沉淀在惰性的多孔纤维素柱上，再用不同浓度的乙醇洗脱，使不同多糖分离开来。纤维素柱色谱原理2012.10.31多糖分子带有电荷，可以与离子交换剂中的离子或基团结合，亲和力随多糖结构与电离性的不同而不同，一般随分子中酸性基团的增加而增强，支链多糖比支链的更易吸附，然后用不同浓度的盐溶液进行洗脱。离子交换色谱原理常用交换剂为阳离子或阴离子交换纤维素。阳离子交换纤维素适用于分离酸性、中性多糖和粘多糖。中性多糖与硼酸络合后可增加酸性，可被阳离子交换纤维素吸附酸性基团多的吸附力强，对于线性分子，分子量大的比小的吸附力强，直链分子比支链分子易吸附2012.10.31分子筛原理，按照分子量的大小不同进行分离。常用葡聚糖凝胶（sephadexG）凝胶柱色谱原理除此之外，还有膜分离技术、超滤膜术等也应用于多糖的分离纯化2012.10.31常用的脱色方法对于植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，对其进行脱色可使其应用范围更加广泛。常用的脱色方法有:离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻土、活性炭等)。

Addyourtitle一般情况下，尽量避免用活性炭处理，因活性炭会吸附多糖，造成多糖损失。2012.10.31黏多糖（又叫酸性黏多糖）是一类广泛存在于动物体内的含糖醛酸和氨基糖残基的复合多糖，这是一类较有发展潜力的新型生化药物或生物制品。提取：黏多糖大多与蛋白质共价结合，首先常用酶降解部分蛋白或用碱使多糖-蛋白质间的键断裂，促进提取时的溶解。然后用普通蛋白沉淀法沉淀蛋白。2）分离：①有机溶剂分离法利用不同浓度的乙醇依次沉淀不同的黏多糖。②季铵化合物沉淀法其含有酸性基团，与表面活性剂形成季铵配合物，然后用不同盐离子浓度解离。③离子交换层析法用阴离子交换剂交换吸附，再用NaCl溶液进行梯度洗脱2012.10.31糖类介绍多糖提取多糖纯化多糖结构分析多糖结构分析2012.10.31多糖是由多个单糖基以糖苷键相连而形成的高聚物多糖的结构包括单糖的组成、糖苷键的类型、单糖的排列顺序3个基本结构因素。多糖的生物大分子结构比蛋白质更为复杂，这不仅因为组成多糖的单糖品种繁多(目前已知的单糖有200多种)，而且即使只有一种单糖组成的多糖其连接方式的不同以及可能有的支链(蛋白质支链较少)造成多糖的结构测定非常困难。2012.10.31概念：多糖由多个单糖以糖苷键相连而成的高分子聚合物。方向：左：非还原端；右：还原端。多糖的性质：胶体溶液、无甜味、无还原性、有旋光性，但无变旋现象。2012.10.31多糖的结构：一级结构：①单糖的组成；②糖苷键的类型；③单糖的排列顺序。二级结构：取决于一级结构，指其分子骨架。2012.10.31多糖的种类：

1）均一多糖(同多糖)：由一种单糖缩合而成。2012.10.31不均一多糖(杂多糖)：由不同类型单糖缩合而成2012.10.31一：分子量及分子式的确定质谱分析测定分子量和分子式。苷类化合物一般极性较大，无挥发性，遇热气化时易于分解，采用电子轰击质谱(EI—MS)常常不能获得分子离子峰。现多采用化学电离质谱(CI-MS)、场解吸质谱(FD-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)等方法来获得分子离子蜂，尤其是ESI-MS及FAB-MS两种质谱法更是目前测定苷类分子量常用的方法。2012.10.31组成苷的苷元和单糖的鉴定

一般是将苷键全水解，用PC检出单糖的种类，糖类的PC常用的展开剂大多为含水的溶剂系统，如正丁醇-醋酸-水(4:1:5)，EtOAc-吡啶-水(2:1:2)等，经显色后用薄层扫描法求得各种糖的分子比。用GC或HPLC对单糖定性定量，GC常以甘露醇或肌醇为内标，用已知单糖作为对照品。NMR谱，也可以有效地鉴定苷分子中糖的种类。苷分子量-苷元分子量，求出糖的数目氢谱中端基质子信号数(5ppm左右)，碳谱中端基碳信号的数目(90-112ppm)。2012.10.31苷元和糖之间连接位置的确定13C-NMR：苷化位移规律，将苷和苷元的碳谱相比较。成苷后，α-C约+8ppm,β-C约-4ppm二维核磁共振谱(如HMQCCOSY及HMBC谱)等技术广泛用于确定连糖位置。2012.10.31糖与糖的连接位置的确定全甲基化物进行甲醇解，分析其甲醇解产物。甲基化法虽然不能解决多糖中单糖的连接顺序，但它对于阐明单糖的连接方式(键构型)、重复结构中某种单糖的数目、末端糖的性质以及分支点的位置等非常有用。2012.10.31采用的方法通常是将这些甲基化的单糖进行了TLC鉴定，并与标准品对照。近来亦有用GC-MS联用仪对其进行鉴定的报道。全甲基化甲醇解：2012.10.31苷键构型的确定酶水解转化糖酶--------水解β-果糖苷键麦芽糖酶--------水解α-葡萄糖苷键杏仁苷酶--------水解β-葡萄糖苷键,专属性较低纤维素酶--------水解β-葡萄糖苷键NMR谱法测定利用端基质子的偶合常数利用α-苷键和β-苷键的端基碳的化学位移差别利用2D-NMR谱2012.10.31糖链连接顺