EGFR(T790M)抑制剂的设计、合成及活性评价

引言肺癌是发病率和死亡人率最高的恶性肿瘤，源于其多药耐药性的层出不穷，5年存活率改善不大，维持在8%～14%，目前我国每年新发病的肺癌患者超过73万人，其中，非小细胞肺癌（NSCLC）占85%左右。据统计，超出50%的亚洲肺癌患者在治疗过程中发生标志物表皮生长因子受体（EGFR）基因突变，主要集中在18～21号外显子区域，包括18/19缺失、19/20插入、L858R、G719X等，其中，T790M突变尤为显著，占EGFR突变的60%以上。当前，针对EGFR突变所开发的靶向精准药物已经发展到了第三代，奥希替尼，尽管其对T790M耐药突变具有良好的治疗效果，但仍不可避免地出现C797S/R和L792F/H等突变现象。因此，接受EGFR靶向药物治疗的患者，需定期进行耐药检测以便及时调整用药方案。2015年，研究中，指出泛激酶抑制剂依鲁替尼可以较为温和地抑制EGFR（T790M）突变的NSCLC细胞系的增殖，对H1975细胞的IC50为1.2

µmol/L。在前期研究中，针对依鲁替尼的高亲脂性（CLogP=4.07）、不良的水溶性和生物利用度，本课题组对其进行了结构优化，成功获得脂水分配系数改善的先导化合物B6（CLogP=2.55），实现体外对H1975细胞系的抗增殖活性和体内对H1975异植瘤抑制活性均优于依鲁替尼。为了确认化合物B6对H1975的作用活性来源，检测了其对EGFR（T790M）激酶的抑制活性，IC50为（22.0±2.6）nmol/L，低于其对其他激酶的抑制活性，并且优于依鲁替尼（IC50=（52.0±4.3）nmol/L）；同时使用Autodock软件对B6与EGFR（T790M）蛋白（PDB：5GNK）进行了对接分析，如下图所示，化合物B6不仅与该蛋白的Met793、Gln791残基形成氢键相互作用；其磺酰烯基也与Cys797形成了稳定的共价键，很好地解释了B6如何使EGFR（T790M）蛋白抑制失活。为了继续探索此类衍生物对EGFR（T790M）突变的NSCLC的治疗效果，挑选生物电子等排体1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺（依鲁替尼的母核）替换了B6的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺，亚甲基四氢吡咯基团则选用同系物碎片（前期研究中所得的优势碎片）进行构效关系研究，如下图B所示，所合成的化合物均进行核磁共振（NMR）和质谱（MS）结构表征及体外生物活性确认。正文部分1

实验部分1.1

主要仪器与试剂1.2

中间体2的制备1.3

（3-碘-1H-4-氨基吡唑[3,4-d]并嘧啶）（4）的制备1.4

中间体5的制备1.5

中间体6的制备1.6

中间体7的制备1.7

目标化合物的制备1.8

目标化合物对EGFR、EGFR（T790M）激酶活性的测试1.9

肺癌细胞系的抗增殖活性测试1.10

化合物与EGFR（T790M）蛋白的对接分析2

结果与讨论2.1

目标化合物的波谱分析目标化合物I1～I3和II1～II3的结构应用1HNMR、13CNMR和MS-ESI进行了表征，现以I1为例予以说明。根据1HNMR分析，化学位移δ

8.26，积分1个氢，单峰，为嘧啶环上的氢（-C4N2H-）；化学位移分别为7.69～7.64、7.46～7.43的两组多重峰，积分均为2个氢，为1,4-取代苯环上的两组对称的氢（-C6H4-）；化学位移δ7.22～7.18的多重峰，积分为5个氢，为单取代苯基上的氢（-C6H5）；化学位移δ6.88、6.18的两组dd峰分别来自烯键上的氢（-C2H3），前者积分1个氢，为端基烯碳C2的氢，后者积分2个氢，则为端基烯碳C1上的氢；化学位移δ4.86，ddd峰，积分1个氢，是4-取代哌啶基中次甲基碳上的氢（-C5NH9）；化学位移δ3.69（d）、2.96（td）、2.21（qd）、2.05（d）的峰，积分均为2个氢，分别为4-取代哌啶基中的4组亚甲基碳上的氢（-C5NH9）。从13CNMR可知，4-取代哌啶基的化学位移处于高场，其他碳原子出峰则位于低场，与化合物实验式相符。此外，再根据ESI-MS确定其分子量为476，确认其结构正确。2.2

目标化合物的激酶活性分析目标化合物对EGFR、EGFR（T790M）的激酶抑制活性如表1所示，取代基为苯氧基苯基取代者（I1～I3）的活性均明显优于胡椒环基取代者（II1～II3）。2.3

目标化合物与EGFR（T790M）蛋白的相互作用分析为了解释I和II系列化合物的构效关系，挑选了化合物I1和II1分别与EGFR（T790M）蛋白进行了共价对接分析。如下图a所示，两者均可与（T790M）蛋白的Gln791、Met793残基形成氢键，与Cys797形成共价键；不同的是，I1的苯氧基苯基较II1的胡椒环基能更好的填充（T790M）蛋白的疏水口袋（图b），这较好地解释了为什么I系列化合物的激酶抑制活性均明显优化II系列化合物，结果与化合物的CLogP值也彼此对应。2.4

目标化合物的抗肺癌细胞增殖活性分析为了进一步确认目标化合物在体外对EGFR（T790M）的抑制活力，分别检测了它们对EGFR（T790M）突变型细胞系H1975、野生型细胞系A549和另一EGFR（Del19）突变细胞系HCC827的抗增殖活性，结果总结于表2。3

结论结论经过体外EGFR（T790M）激酶活性测试及对接分析，确认先导化合物B6对H1975细胞系的抗增殖活性及异植瘤模型的抑瘤效果源于其对EGFR（T790M）的显著抑制。基于此靶点及前期研究基础，以4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶为原料，经过6步反应，合成了6个目标化合物。其中，化合物II1对3种非小细胞肺癌细胞系的