肿瘤靶向性多功能亚硝基脲的合成及抗肿瘤活性评价

摘要氯乙基亚硝基脲（CENUs）是临床上重要的抗肿瘤药物，该类药物通过诱导形成DNA股间交联（dG-dC交联）发挥抗肿瘤作用。但O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（O6-alkylguanine-DNAalkyltransferase,AGT）介导的细胞耐药性及明显的毒副作用降低了其抗癌效果。通过合成了一种肿瘤靶向性多功能亚硝基脲，该化合物由具有低氧选择活性的偶氮苯衍生物、能够抑制AGT活性的O6-苄基鸟嘌呤衍生物和氯乙基亚硝基脲三部分组成。该化合物能够特异性地在低氧肿瘤区域被还原，释放AGT抑制剂和氯乙基亚硝基脲，从而发挥靶向抗肿瘤作用。多功能亚硝基脲及其各中间产物的化学结构经高分辨质谱、1HNMR、13CNMR及IR数据确证。用CCK-8法评价了上述化合物对人脑神经胶质瘤SF763细胞的增殖抑制活性；并用荧光成像法评价了该化合物对SF763细胞的促凋亡活性。结果表明，与临床一线亚硝基脲类抗肿瘤药物尼莫司汀相比，多功能亚硝基脲能够更有效地抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡，并具有明显的低氧靶向性。

前言氯乙基亚硝基脲（Chloroethylnitrosoureas,CENUs）是一类广谱抗肿瘤烷化剂，尤其在脑瘤、黑色素瘤和恶性淋巴瘤等的治疗中表现出了良好的效果。目前临床上常用的CENUs包括卡莫司汀（BCNU）、洛莫司汀（CCNU）、尼莫司汀（ACNU）、雷莫司汀（MCNU）等。CENUs通过诱导形成DNA股间交联（dG-dC交联），阻碍肿瘤细胞中DNA的复制及转录过程，促进细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。但临床应用发现，由O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（O6-alkylguanine-DNAalkyltransferase,AGT）介导的DNA损伤修复作用能够引发肿瘤细胞耐药性，这严重影响了CENUs的化疗效果，大大限制了这类药物的临床应用。AGT是一类广泛存在于细胞中的DNA损伤修复蛋白，尤其是在许多肿瘤细胞中高表达。AGT通过将受损DNA鸟嘌呤O6位上的烷基基团转移到自身第145位半胱氨酸残基上来完成DNA修复。这种修复作用使得肿瘤化疗过程中由烷化剂造成的肿瘤细胞DNA损伤被修复，导致肿瘤细胞对烷化剂产生耐药性。为克服这一问题，一系列AGT抑制剂被陆续开发以用于与CENUs的联合用药。O6-苄基鸟嘌呤（O6-benzylguanine,O6-BG）和O6-4-溴苄基鸟嘌呤（O6-(4-bromothenyl)guanine,O6-4-BTG）是目前仅有的两个进入临床阶段的AGT抑制剂，它们自身的苄基基团被AGT转移到活性中心Cys145残基上，生成结构稳定的S-苄基半胱氨酸，不可逆的抑制了AGT活性，从而消除了AGT介导的肿瘤细胞耐药性。可见，AGT抑制剂能够有效提高肿瘤细胞对烷化剂的敏感性，增强烷化剂的抗肿瘤效果。本课题组合成了一种具有AGT抑制剂和CENUs双药效团的新型联合亚硝基脲BGCNU，该化合物表现出了明显高于ACNU和BCNU的抗肿瘤活性。然而，由于目前大多数AGT抑制剂不具有肿瘤靶向性，在抑制肿瘤细胞AGT活性的同时也抑制了正常细胞的AGT活性，使得正常细胞中的DNA损伤加剧，造成化疗药物的毒副作用增强，最终往往导致化疗失败。因此，开发具有肿瘤靶向性的AGT抑制剂和CENUs成为解决这一问题的关键。低氧是肿瘤微环境的显著特性之一[19]，相对于氧浓度为29%（40mmHg）的正常细胞，肿瘤微环境中的氧浓度仅约为0.02%（<2.5mmHg）。在实体瘤组织中，肿瘤细胞的快速增殖导致耗氧增加，但肿瘤微血管结构异常导致供氧不足，这种快速耗氧与有限供氧之间的不平衡造成了肿瘤组织低氧。近年来，基于低氧开发肿瘤靶向药物已成为研究热点。其中，低氧激活前药（hypoxiaactivatedprodrugs,HAPs）能够选择性地在低氧肿瘤组织中发挥药效，同时对常氧区域的正常细胞毒性较低或无毒性。因此，开发具有低氧选择性的新型亚硝基脲对提高该类药物的化疗效果、降低毒副作用具有重要意义。本研究设计合成了一种同时含有AGT抑制剂药效团和低氧激活基团的多功能亚硝基脲（7），其作用机制如下图所示。化合物7在生理条件下氯乙基亚硝基脲部分经过分解生成重氮正离子导致鸟嘌呤烷基化，进而形成dG-dC股间交联；同时，在肿瘤低氧条件下，偶氮苯-O6-苄基鸟嘌呤部分经过多步单电子还原N=N发生断裂，生成O6-苄基鸟嘌呤衍生物，靶向性地抑制肿瘤细胞中的AGT活性，从而实现靶向抗肿瘤和抗耐药的目的。本文通过细胞增殖活性实验和凋亡检测评价了化合物7的抗肿瘤活性和低氧选择性。正文部分1

实验部分1.1

主要仪器与试剂1.2

实验方法1.2.1

合成路线及方法(E)-(3-((4-(二丙基氨基)苄基)二氮烯基)苄基)甲醇（1）、1-(2-氨基-9H-嘌呤-6-基)-1-甲基吡咯烷-1-鎓氯化物（2）由实验室自行合成。1.2.2

细胞培养人脑神经胶质瘤细胞SF763选用MEM培养基（含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素），置于37°C、5%CO2培养箱中传代培养。待细胞融合度达80%～90%进行传代。1.2.3

细胞毒性实验将生长状态良好的SF763细胞经胰酶消化、离心、计数后以5×103个/每孔接种于96孔板，置于37°C，5%CO2培养箱中培养。1.2.4

细胞凋亡实验将生长状态良好的SF763细胞经胰酶消化、离心、计数后以4×104个/每孔接种于48孔板，置于37°C，5%CO2培养箱中培养。1.2.5

统计学分析采用SPSS软件进行数据统计及分析，结果以平均值±标准偏差（S.D.）表示。2

结果与讨论2.1

细胞增殖抑制活性评价为评价目标化合物7的肿瘤细胞增殖抑制活性和低氧选择性，本研究选取了AGT高表达的SF763细胞，用CCK-8法检测了传统氯乙基亚硝基脲ACNU和化合物7在常氧和低氧条件下作用24h后SF763细胞的存活率，结果如图1所示，各种药物的半数抑制浓度（IC50）列于表1。2.2

细胞凋亡分析CENUs是通过损伤细胞DNA进而导致细胞凋亡发挥抗肿瘤作用的，因此可以通过评价CENUs促进肿瘤细胞凋亡的能力来反映其抗肿瘤活性。3

结论结论本文设计合成了一种同时含有AGT抑制剂药效团和低氧激活基团的多功能CENUs前药。该化合物以偶氮基团为低氧激活药效团，氮氮双键能够特异性地在肿瘤低氧区域被还原，释放出O6-BG衍生物，靶向性地抑制肿瘤组织中AGT的活性，增强肿瘤细胞对烷化剂的敏感性。同时，化合物中的CENUs药效团分解生成氯乙基碳正离子，导致DNA股间交联，发挥抗