细胞生物学实验细胞融合

概念促融合剂与融合技术应用与意义

重点细胞生物学实验细胞融合第1页一定义：Cellfusion细胞融合：(Cellfusion)又称体细胞杂交（somatichybridization）是指将不一样起源原生质体(除去细胞壁细胞)相融合，将两个或多个细胞合并成一个细胞技术。细胞生物学实验细胞融合第2页细胞生物学实验细胞融合第3页人心肌细胞人肝脏细胞种内杂交细胞人细胞鼠细胞种间杂交细胞细胞生物学实验细胞融合第4页在适当条件下，细胞融合在一起，产生含有原来两个细胞基因信息单个核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。种内杂交细胞（intraspecifichybridcell）:同种细胞融合而成细胞种间杂交细胞（interspecifichybridcell）:不一样种细胞融合而成细胞细胞生物学实验细胞融合第5页非对称细胞融合（asymmetricfusion）：利用物理或化学方法使某亲本细胞核或细胞质失活后再进行融合。细胞生物学实验细胞融合第6页细胞核或细胞质失活有物理和化学方法：1.物理方法，如X射线、r射线等，它们能使细胞核失活；2.化学方法，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－G，它是一个亲脂染料，能够抑制线粒体氧化磷酸化过程而到达失活作用。细胞生物学实验细胞融合第7页动物克隆细胞生物学实验细胞融合第8页上海第二医科大学陈莹博士年，她将一5岁男孩包皮细胞与一只已去除细胞核新西兰兔卵母细胞融合，取得了人类早期胚胎。细胞生物学实验细胞融合第9页二细胞融合原理细胞生物学实验细胞融合第10页荧光标识小鼠细胞和人细胞融合试验将小鼠抗体与发绿色荧光荧光素(fluorescin)结合,人抗体与发红色荧光罗丹明(rhodamine)结合；细胞生物学实验细胞融合第11页显微镜下细胞融合过程

细胞生物学实验细胞融合第12页细胞融合过程细胞相互靠近细胞膜融合细胞桥形成细胞质融合细胞核融合细胞生物学实验细胞融合第13页细胞融合主要经过了两原生质体或细胞相互靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融合主要步骤。

细胞桥形成是细胞融合最关键一步，融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥。细胞生物学实验细胞融合第14页

细胞融合过程中两个细胞膜改变

形成细胞桥详细改变细胞生物学实验细胞融合第15页细胞融合分为两种：1.自发细胞融合2.人工诱导细胞融合细胞生物学实验细胞融合第16页（1）自发细胞融合

自发细胞融合（spontaneouscellfusion）是在未施加任何诱导条件情况下所发生细胞融合现象。

自发细胞融合现象在自然界中并不多见，常见主要有以下几个情况：

1.精子和卵子受精

2.肌管形成

3.胚胎着床

4.巨细胞形成

5.

破骨细胞形成

6.

肿瘤细胞融合细胞生物学实验细胞融合第17页（2）诱导细胞融合人工诱导细胞融合是在人为条件下发生细胞融合现象惯用诱导方法有三种：

1.生物法（病毒诱导法等）

2.化学法（PEG诱导法、Ca2+诱导法、溶血卵磷脂诱导法等）

3.物理法（电诱导法等）细胞生物学实验细胞融合第18页1.病毒诱导法

惯用病毒：仙台病毒（Sendalvirus),又称日本血凝病毒（HemagglutinatingvirusofJapan,HVJ）属于副粘液病毒科，RNA病毒，圆球形

1962年，日本仙台东北大学学者冈田发觉仙台病毒可诱导细胞融合。

细胞生物学实验细胞融合第19页病毒促使细胞融合

两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近，使两个细胞膜、胞质间相互渗透--------细胞核相互融合，进入正常细胞分裂路径，杂种子细胞。

细胞生物学实验细胞融合第20页2化学法（聚乙二醇）PEG:聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）分子式：HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH性状：白色蜡状固体，含有强烈凝集、沉淀蛋白质作用分子量〉1000-6000u，可作诱融剂。20世纪70年代，华裔科学家高国南发觉聚乙二醇能诱导细胞融合细胞生物学实验细胞融合第21页分子量小PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。pH偏碱时融合效应最高。用作细胞融合剂聚乙二醇普通选取分子量为4000者，惯用浓度为50％，pH8.0~pH8.2

细胞生物学实验细胞融合第22页聚乙二醇普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞膜结构，使两细胞接触点处质膜脂类分子发生疏散和重组，因为两细胞接口处双分子层质膜相互亲和以及彼此表面张力作用，从而使细胞发生融合

细胞生物学实验细胞融合第23页

基本原理聚乙二醇(PEG)是一个多聚化合物，商品名卡波蜡(Carbowax)。细胞生物学实验细胞融合第24页聚乙二醇（PEG）介导细胞融合

原理：PEG带有大量负电荷,和原生质体表面负电荷在钙离子连接下，形成静电键，促使异源原生质体间粘着和结合，在高pH,高钙离子溶液作用下，将钙离子和与质膜结合PEG分子洗脱，造成电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上正负电荷连接起来，进而形成含有共同质膜融合体。

细胞生物学实验细胞融合第25页融合过程中应注意①事先要做好两种原生质体识别标识，如色素、缺点型、抗性标识等。②原生质体密度应在105个／mL左右，两种原生质体按1：1等量混合。③惯用PEG分子量通常为4000~6000，加热熔化与Eagle溶液配成50％(W／V)浓度(小分子质量PEG配成55％浓度)。加入PEG后，24℃培育10~20min注意时间宜短不宜长，过长，使原生质体周围包裹一层膜形成凝集体，会降低融合率)，缓缓加入高pH、高钙离子溶液15min后用冲洗液清洗，离心搜集原生质体。细胞生物学实验细胞融合第26页3.物理法一电融合诱导法1981年，Scheurich和Zimmermann创造了电诱导细胞融合。电融合槽在直流电脉冲诱导下，原生质体质膜表面电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整膜形成融合体。

细胞生物学实验细胞融合第27页细胞电融合原理：悬于大小不一样两平行电极间低导电率溶液中细胞，在1—100MHz和100—1000V/cm交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场方向发生双向电泳，此时再加上适当强度和连续时间高压电脉冲，即可使相邻细胞膜接触区产生可逆电降解，从而触发细胞融合。细胞生物学实验细胞融合第28页+--+-+-+---+偶极子电诱导法原理+---+细胞生物学实验细胞融合第29页双向电泳：在交流电场作用下（1MHz，150V/cm）细胞膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化细胞会发生相互紧密接触。细胞生物学实验细胞融合第30页细胞生物学实验细胞融合第31页细胞生物学实验细胞融合第32页原生质体电融合过程1）在高频电流电场下相互接触。2）脉冲刺激后30s3)50秒后4）1.5分钟后5）6分钟后6）15分钟后，原生质体融合完成。细胞生物学实验细胞融合第33页注意事项1）对介质要求高，普通用高纯度蒸馏水并选取适当非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压强度和时间，以预防细胞连接成串或发生可逆性降解。细胞生物学实验细胞融合第34页优点：融合率高，达70％－80％，甚至100％可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、方便简单；免去PEG诱导后洗涤过程、诱导过程可控制性强等。细胞生物学实验细胞融合第35页融合指数（fusionindex）:反应细胞融合效率有两种计算方法：1.FI=（对照组细胞数-试验组细胞数）/试验组细胞数2.FI=多核细胞中细胞核数/全部细胞中细胞核数细胞生物学实验细胞融合第36页不一样细胞融合条件及其主要应用起源前处理融合方法主要应用动物细胞不需仙台病毒,PEG，电融合生产单克隆抗体植物细胞脱壁PEG,电融合创造植物新品种微生物细胞脱壁PEG,高产优质新菌种细胞生物学实验细胞融合第37页AABBAABBBAAB同核体同核体异核体（杂交细胞）未融合未融合加入融合剂融合细胞类型

细胞生物学实验细胞融合第38页同核体：由同一亲本细胞融合而来异核体：

（heterokaryon）有不一样亲本细胞融合而来异核体其细胞膜融合在一起，而融合细胞含有两个不一样细胞核。细胞生物学实验细胞融合第39页动物细胞融合影响原因

动物细胞融合中，除促融剂外，其它如细胞性质、温度、pH、离子强度及离子种类等均全影响细胞融合效率。

①亲本细胞表面性质影响较大②细胞种类不一样，融合效果也不一样，如腹水癌及株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。③细胞融合时需要适宜温度和运动状态。

如仙台病毒诱导-腹水癌细胞融合时，于37℃振摇时易于融合，且融合效率与病毒量呈正比。但在34℃振摇则融合率下降。在37℃时不振摇则-不融合。细胞生物学实验细胞融合第40页④细胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20％时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件也可融合。⑤有些细胞融合时需要Ca2+，不然不融合，细胞蛋白质亦发生改变。

试验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替Ca2+，但有效浓度较Ca2+大多。融合时最适合离子强度普通为0.1mol/L。⑥最适合pH为7.4-7.8之间，在此范围之外，融合率均较低。细胞生物学实验细胞融合第41页比较惯用杂种细胞筛选方法1遗传互补筛选法：2营养互补筛选：3温度敏感筛选法细胞生物学实验细胞融合第42页1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功效正常等位基因，纠正另一亲本缺点，令杂种细胞表现正常。亲本A：HGPRT-/TK+亲本B：HGPRT+/TK-杂交细胞：HGPRT+/TK+在HAT培养基中杂交细胞存活，A、B死亡细胞生物学实验细胞融合第43页2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几个营养成份时，不能生长繁殖即营养缺点型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理能够筛选杂种细胞。亲本A：色氨酸缺点型亲本B：苏氨酸缺点型杂种细胞能够在不含色氨酸和苏氨酸培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。细胞生物学实验细胞融合第44页3）温度敏感突变型杂种细胞筛选：普通培养细胞能在32度到40度范围内生长，但温度敏感突变型细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。亲本一：低温敏感突变型，可在低温下生长，在高温下死亡。亲本二：高温敏感突变型，可在高温下生长，在低温下死亡。杂种细胞能在高温和低温下生长。细胞生物学实验细胞融合第45页细胞融合应用1.用于基因定位2.用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗2.用于动物育种3.用于细胞治疗4.用于生产单克隆抗体5.用于研究核质关系和肿瘤发生机制细胞生物学实验细胞融合第46页细胞融合应用一.单克隆抗体

1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而取得1984年诺贝尔医学和生理学奖。细胞生物学实验细胞融合第47页TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984"forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies"GeorgesJ.F.Koehler

FederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunology

Basel,Switzerlandb.1946d.1995

CarMilstein

ArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiology

Cambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)

d.科莱尔米尔斯坦细胞生物学实验细胞融合第48页单克隆抗体概念单:单个细胞克隆:无性繁殖抗体:化学性质单一、特异性强细胞生物学实验细胞融合第49页亲本细胞准备

细胞融合杂交瘤细胞筛选可分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞克隆化培养单克隆抗体生产和纯化生产过程细胞生物学实验细胞融合第50页单克隆抗体大量制备过程一细胞融合前准备(一)动物免疫与免疫脾细胞悬液制备在腹腔免疫1－2次后2－4周，于融合前3—4天加强免疫一次，这么能够使抗原最近激活B淋巴细胞定位于脾脏，也使记忆细胞处于激活与分裂状态。许多资料结果表明，脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤最正确时间，是在抗体形成高峰之前，而不是在抗体形成高峰期。可溶性抗原免疫量常为10-100ug，经皮下或腹腔注射免疫1-2次（间隔2-3周），3周后50-500ug抗原加强免疫，加强免疫一定要静脉注射或腹腔内注射，确保抗原抵达脾脏。细胞抗原惯用2×107用细胞腹腔注射，不需佐剂。

普通取最终一次加强免疫3天以后脾脏，制备成细胞悬液。细胞生物学实验细胞融合第51页淋巴细胞：经过免疫处理淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：体内法或体外法。体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。3－4天后，在无菌条件下能够取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95％以上能够用于融合。体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，3－4天后，搜集被刺激淋巴细胞。细胞生物学实验细胞融合第52页小牛血清选择①供血新生小牛必须是健康牛产仔，并在产后24小时内抽血，此期间不得吸收母乳。②以无菌操作自颈动脉放血，并在无菌条件下分离血清及滤菌，全过程在36小时内完成。经滤菌血清置－20℃保留。③血清使用前需做细菌、支原体培养及内毒素测定，在确实无污染情况下方可使用。④每批小牛血清测定总蛋白含量并分别配成10％、20％、25％于基础培养基和HAT培养基中，对骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞进行培养，观察小牛血清对瘤细胞和融合细胞细胞毒性。⑤轻微溶血血清，而无细胞毒性者仍可应用。⑥在用血清做细菌培养时，应置于细胞培养瓶内进行，培养期间随时可放于倒置显微镜下观察，可防止因为肉眼观察疏忽。细胞生物学实验细胞融合第53页B淋巴细胞准备红细胞将红细胞注入小鼠皮下或腹腔取出脾脏B淋巴细胞

亲本细胞准备细胞生物学实验细胞融合第54页(二)骨髓瘤细胞取得与培养

骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这么杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一晶系小鼠腹腔内产生大量McAB。骨髓瘤细胞培养可利用普通动物细胞培养液。小牛血清浓度普通在10％—20％，细胞最大密度不得超106个／ml，普通扩大培养以1：10稀释传代，每3-5天传代一次。细胞倍增时间为16-20h。亲本细胞准备细胞生物学实验细胞融合第55页骨髓瘤细胞准备

骨髓瘤细胞：是癌变浆细胞，能够分泌免疫球蛋白，所以必须选择不分泌免疫球蛋白缺点型骨髓瘤细胞，多用BALB/C小鼠骨髓瘤细胞。

细胞生物学实验细胞融合第56页

细胞融合加入PEG作融合剂B淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞1234细胞生物学实验细胞融合第57页二细胞融合融合条件除了融合剂以外，还包含温度、培养基和培养板等。我们首先分析用PEG作融合剂时条件选择。因为作用时间不一样对细胞毒性也不一样。用于融合分子量普通在1000－4000，普通作用浓度在35％－50％之间，PEG作用1－2分钟，以PH8.0－8.2时融合率最高。细胞生物学实验细胞融合第58页小白鼠脾臟細胞B

與癌細胞N

以PEG進行融合，操作在10min內完成(以下圖)，隨即把細胞平均分配在96槽細胞培養盤中

细胞生物学实验细胞融合第59页细胞融合：1.脾细胞准备；拉颈处死小鼠；无菌操作取出脾脏；清洗、研磨。2.制备脾细胞悬液:搜集细胞；离心洗涤；细胞计数。3.准备骨髓瘤细胞:搜集细胞；离心洗涤；活细胞计数；调整细胞浓度，骨髓瘤细胞与小鼠脾胞按一定百分比混合。4.细胞融合剂选择：病毒，PEG。5.细胞融合：在聚乙二醇作用下各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。细胞生物学实验细胞融合第60页将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1或10：1百分比混匀于50ml锥形离心管内。1200rpm离心7—10分钟，尽可能吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀细胞铺展成薄层。在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%PEG0.5ml，随即静置90秒。再于5分钟内边振摇边逐滴加入5－10ml不含血清培液或盐水缓冲液，以终止PEG作用，再静置10分钟。细胞生物学实验细胞融合第61页融合细胞早期观察及其异常结果分析：1．融合后细胞早期观察与管理；2．无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析；3．转种与扩大培养过程中杂交瘤细胞生长；4．不出现杂交瘤原因分折。细胞生物学实验细胞融合第62页三杂交瘤细胞筛选融合将细胞转移到HAT培养基中培养HAT1234细胞生物学实验细胞融合第63页HAT培养基筛选杂交瘤细胞细胞团块分散后，加HAT溶液，稀释至骨髓瘤细胞不超出2×105ml，即可加入有喂养细胞96孔塑料培养板内每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；总量分别为0.2ml和1ml。用HAT选择性培养时每隔2－3天半量换液，7天后能够选择出杂交瘤细胞。细胞生物学实验细胞融合第64页HAT选择系统HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）一个选择性培养基，其中三种成份与细胞DNA合成相关。DNA合成路径有两种。细胞生物学实验细胞融合第65页杂交瘤技术中，常选取次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺点（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺点型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。HPRT-细胞嘌呤只能由全合成路径产生；TK-

细胞嘧啶只能由全合成路径合成。含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶全合成路径。细胞生物学实验细胞融合第66页淋巴细胞含有合成DNA两条路径。杂种细胞经过互补作用取得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，经过补救合成路径合成DNA。在HAT培养基中，HPRT-

或TK-

亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐步死亡，只有杂种细胞存活。细胞生物学实验细胞融合第67页四可分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞筛选HAT将培养皿孔内上清液取出，检测抗体。惯用方法有：放射免疫测定、酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。融合细胞生物学实验细胞融合第68页五杂交瘤细胞克隆化培养123456融合HAT细胞生物学实验细胞融合第69页杂交瘤细胞克隆化培养利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定分泌特异抗体细胞系。在培养过程中，普通要加能释放一些生长因子促进杂交瘤生长喂养细胞，如小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。细胞生物学实验细胞融合第70页克隆化目标

1）是细胞建株必经过程，以得到遗传特征相同细胞；

2）就杂交瘤而言，可从中筛选出稳定而同源杂种细胞系，淘汰遗传不稳定杂交瘤细跑。

3）降低非分泌型无关细胞生长过快。

注意事项：①待克隆细胞生优点于对数增加期；②小牛血清质量和浓度；③细胞计数要准确；④及时观察细胞生长情况。

细胞生物学实验细胞融合第71页喂养细胞种类和作用

对于培养小鼠细胞来说，主要有以下各种细胞可供作为其喂养细胞：

①胸腺细胞,用量为106/0.2ml

②正常脾细胞；

③传代培养中大鼠胚胎成纤维细胞；

④腹腔细胞其用量为2×104/0.2ml，腹腔细胞是使用得最普遍喂养细胞。

胚胎成纤维细胞因在细胞培养条件下有分裂增殖能力，故只适应于软琼脂平板法培养中，该细胞铺于平板底层。细胞生物学实验细胞融合第72页

喂养细胞作用

①提升培养细胞密度，使待克隆细胞轻易生存与繁殖。

②腹腔细胞能去除培养中死亡细胞，从而促进单个细胞克隆生长。

③喂养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进细胞分裂、增殖作用。

细胞生物学实验细胞融合第73页1.有限稀释法稀释细胞生物学实验细胞融合第74页1）有限稀释法

有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到10个/ml，然后装成每小孔(96孔板)0.1ml，使每孔理论上含有单个细胞，经过培养后即可取得单个细胞形成集落。

有限稀释法举例：

1.取1.0ml5×104ml细胞+4ml培养基稀释，得1×104/ml.

2.取0.5ml1×104ml细胞液+4.5ml培养基稀释，得1×103/ml.

3.取1.0ml1×103ml细胞液+4.5ml培养基稀释，得1×102/ml.

细胞生物学实验细胞融合第75页2.软琼脂培养法在加入喂养细胞无菌平皿内铺上一层0.5％琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞0.25％软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含喂养细胞96孔板内。

细胞生物学实验细胞融合第76页2）软琼脂培养法：

本法对于一些抗原，能够把克隆化培养与特异性筛选测定结合起来进行，所以它特点是效率较高，速度较快。但缺点是克隆率不高。基本原理是利用单个细胞在软琼脂培养基上局限化生长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从琼脂上挑出来(普通8—10天后)，再移到液体培养基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液活性。也能够用溶血空斑技术或围绕集落形成免疫沉淀方法来直接测它活性。细胞生物学实验细胞融合第77页3.显微镜操作法细胞生物学实验细胞融合第78页3）显微镜操作法

在倒置(或解剖)显微镜下，借助于毛细吸管将单个细胞个别吸出，分别放入已加喂养细胞96孔培养孔内，依据原理不一样，又分为普通法和玫瑰花结两种方法。

普通显微镜操作法：于6cm平皿中，假如约103个细胞；CO2培养基箱中静置1小时左右无菌条件；在倒置显微镜下去平皿盖用直角转头滴管，吸出单个细胞移至预先加有喂养细胞96孔板内直至96孔均分装有细胞，加盖；于CO2培养箱内培养观察与更换培养方法同有限稀释法。

玫瑰花结原理：分泌抗体细胞在其表面含有抗原受体，在—定条件下常可与特异性抗原致敏羊红细胞形成玫瑰花结。假如从免疫动物脾细胞中除去能形成特异性玫瑰花结细胞则失去对特异性抗原反应性。

细胞生物学实验细胞融合第79页4.荧光激活分离法细胞生物学实验细胞融合第80页荧光激活细胞分离器法(FluoresemuactivatedCellSortu，FACS)

用本仪器分离单细胞原理是将悬液中细胞引入一个液流中央，使其一个接一个地经过聚焦高能激光束，依据荧光和光放射性质快速分析和分离细胞。

细胞生物学实验细胞融合第81页5）盖片分离法

1.用钉锤于洁净橡胶上砸洁净盖片；

2.选择碎块、大小形态适用选出；

3.加培养液及进行细胞培养；

4.倒置镜下选细胞，挑出单细胞玻片；

5.进行单个细胞培养。

细胞生物学实验细胞融合第82页细胞生物学实验细胞融合第83页

细胞生物学实验细胞融合第84页大量生产单克隆抗体：(1)体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体；（2）体nei杂交瘤细胞制备腹水或血清1)实体瘤法：对数生长久杂交瘤细胞接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml.肿瘤到达一定大小后则可采血，从血清取得单克隆抗体。细胞生物学实验细胞融合第85页2）腹水制备：腹腔注射1x106杂交瘤细胞，按种细胞7-10天后可产生腹水。也可用注射器抽取腹水，可重复搜集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，能够将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。

细胞生物学实验细胞融合第86页防止夭折方法可采取：①换液动作轻柔、换液量不超出1/2；②防止重复取出CO2培养箱，不宜经常换液；③不轻易更换新批号小牛血清。及时判断阳性孔也是一项主要工作，可起降低工作量和确保重点杂交细胞双重作用，待集落生长到96孔板孔1/3左右，24孔板1/5左右，就要及时测定各孔上清中是否会有特异性抗体，一旦发觉抗体阳性孔，就应马上扩大培养，再冻存和克隆化，以免被其它细胞生长所压抑或意外丢失。无分泌特异性抗体杂交瘤原因分析：融合后经HAT选择有细胞克隆出现，但不能筛选出产生特异抗体杂交瘤，常见原因是：①抗体检测法不够敏感；②HAT选择失败；③染色体丢失和克隆竞争；④动物免疫不成功。细胞生物学实验细胞融合第87页杂交瘤细胞产生单克隆抗体示意图细胞生物学实验细胞融合第88页单克隆抗体应用主要用于疾病诊疗、治疗和预防。与常规抗体相比，含有特异性强、灵敏度高优点。如；各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫等数百种疾病诊疗；在疾病治疗方面，单克隆抗体如同人体卫士，能识别“自己”与“异己”，一旦发觉致病原因便与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药品制成“生物导弹”，将药品定向带到癌细胞所在部位，既毁灭了癌细胞又不会伤害健康细胞细胞生物学实验细胞融合第89页美国科学家采取细胞融合技术将番茄和马铃薯细胞融合在一起，培育出称之为“番茄薯”或“薯番茄”新型植物。植株地上部结番茄，地下部生长根茎，产量高，品质好。细胞生物学实验细胞融合第90页细胞生物学实验细胞融合第91页动物细胞融合与单克隆抗体

思索与探究

1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不一样？

提醒：植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不一样是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。

细胞生物学实验细胞融合第92页2.制备单克隆抗体时，为何要选取B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？

提醒：哺乳动物感染抗原后，其体内会形成对应B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌对应抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应过程中，每一个B淋巴细胞能分泌一个特异性抗体，要想取得大量特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞含有产生单一抗体能力，但不能在体外增殖骨髓瘤细胞是一个癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。所以，把一个B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞特征──在体外培养条件下能不停增殖，同时能产生出某种特异性抗体。细胞生物学实验细胞融合第93页3已成功动物细胞融合实例还有哪些？生物种类细胞起源成功年代酵母菌—鸡原生质体—

血红细胞1975年人—胡萝卜腹水癌细胞—原生质体1976年人—小鼠纤维肉瘤细胞—畸胎瘤细胞1978年细胞生物学实验细胞融合第94页4.为何不