MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座

MICRORNA与肿瘤郭志云MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第1页中国癌症发病现实状况我国近20年来癌症展现年轻化及发病率和死亡率“三线”走高趋势《中国肿瘤登记年报》报道，每分钟就有6人确诊为癌症MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第2页中国癌症发病现实状况男性死亡率高于女性数据起源于24个省72个监测点，覆盖8500万人。年报显示，每年新发肿瘤病例约为312万例，平均天天8550人，全国每分钟有6人被诊疗为癌症。恶性肿瘤发病率全国35岁至39岁年纪段为87.07/10万，40岁至44岁年纪段几乎翻倍，到达154.53/10万；50岁以上人群发病占全部发病80%以上MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第3页中国癌症发病现实状况肺癌居癌症死亡首位从病种看，居全国恶性肿瘤发病第一位是肺癌，其次为胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌，前10位恶性肿瘤占全部恶性肿瘤76.39%。居全国恶性肿瘤死亡第一位仍是肺癌，其次为肝癌、胃癌、食管癌和结直肠癌，前10位恶性肿瘤占全部恶性肿瘤84.27%。死亡率最高者男女均为肺癌。MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第4页中国癌症发病现实状况癌症呈地域分布显著肺癌主要集中在东北、云南;食管癌高发区主要集中在河南、河北等中原地域；胃癌高发区主要集中在西北及沿海各省，如上海、江苏、甘肃、青海等较为突出；肝癌高发区集中在东南沿海及东北吉林等地域。

MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第5页中国癌症村地图MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第6页BBCNEWSREPORTChinaacknowledges'cancervillages'China'senvironmentministryappearstohaveacknowledgedtheexistenceofso-called"cancervillages"afteryearsofpublicspeculationabouttheimpactofpollutionincertainareas. 22FebruaryMicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第7页什么是肿瘤?肿瘤是机体在各种致瘤原因作用下，局部组织细胞在基因水平上失去对其生长正常调控，造成克隆性异常增生而形成新生物，常表现为局部肿块。

依据肿瘤生物学特征及其对机体危害性不一样，将肿瘤分为良性与恶性，后者常见为癌与肉瘤MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第8页肿瘤十大特征MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第9页肿瘤十大特征自给自足生长信号（Self-SufficiencyinGrowthSignals）抗生长信号不敏感（InsensitivitytoAntigrowthSignals）抵抗细胞死亡(ResistingCellDeath)潜力无限复制能力(LimitlessReplicativePotential)连续血管生成(SustainedAngiogenesis)组织浸润和转移(TissueInvasionandMetastasis)防止免疫摧毁(AvoidingImmuneDestruction)促进肿瘤炎症（TumorPromotionInflammation）

细胞能量异常（DeregulatingCellularEnergetics）基因组不稳定和突变（GenomeInstabilityandMutation）MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第10页RNA种类及主要功效RibosomalRNAs(rRNAs):translationTransferRNAs(tRNAs):translationMessengerRNAs(mRNAs):proteintemplateNoncodingRNAs(ncRNAs):varioustypesandfunctionsMicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第11页NON-CODINGRNA:FORMERLYKNOWNAS“JUNK”MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第12页non-codingRNA

(20-0nt)RNAmRNAsmallnon-codingRNA(miRNA)(20-500nt)longnon-codingRNA(lncRNA)(>500-0nt)MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第13页人类基因组草图带给科学家们迷惑

含有30亿对碱基人类基因组仅含有2－3万个蛋白质基因，是果蝇两倍，啤酒酵母4倍。显而易见，生物复杂性不由编码蛋白质数目决定。人类基因组蛋白质编码区总和占总基因组长度为1－2％，那么其它98％基因组有什么功效呢？当然，在这98％非蛋白质编码基因组序列里，约24％为插入编码序列内含子序列；人类基因平均每个基因有7个内含子。但这么冗长内含子序列有什么生物学功效呢？MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第14页WhatisnoncodingRNA?Non-codingRNA(ncRNA)isaRNAmoleculethatfunctionswithoutbeingtranslatedintoaproteinFromWikipedia,thefreeencyclopediaMicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第15页microRNAMicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第16页ThediscoveryofmiRNAsmiRNAwasfirstdiscoveredin1993byVictorAmbrosatHarvard(lin-4)ThesecondmiRNALet-7wasdiscoveredinbyFrankSlackasapostdocatHarvard

(Ruvkunlab)VictorAmbrosGaryRuvkunMicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第17页18诺贝尔生理学奖取得者：AndrewZ.FireCraigC.MelloMicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第18页MICRORNAMicroRNA是一个长度约为21nt单链非编码小分子RNA在进化过程中高度保守其经过与靶基因序列3’UTR区特异性结合，诱导靶mRNA降解或阻遏其翻译MiRNA预计调控超出60%蛋白编码基因而且参加近乎全部已知细胞进程MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第19页miRNAgene

pri-miRNA(stem-loopstructure)processedbyDrosha

pre-miRNA(65~90bp)carriedbyExportin5tocytoplasm

maturemiRNA(20~25bp)isgeneratedbytheRNaseIIItypeenzymeDicer

directedbyRISCtothemiRNAtarget

mRNAcleavageorimpedeitstranslationintoproteinmicroRNA合成MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第20页(1)microRNA(miRNA)简写成miR，再依据其被克隆先后顺序加上阿拉伯数字，如miR-21；

(2)高度同源miRNA在数字后加上英文小写字母(a、b、

c)，如miR-199a和miR-199b；

(3)由不一样染色体上DNA序列转录加工而成含有相同成熟体序列miRNA，则在后面加上阿拉伯数字以区分,如miR-199a-1和miR-199a-2；

miRNA命名规则MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第21页(4)假如一个前体2个臂分别加工产生miRNA，则依据克隆试验，在表示水平较低miRNA后面加“*”，如miR-199a和miR-199a*，或进行以下命名，miR-142-5p和miR-142-3p；

(5)将物种缩写置于miRNA之前，如hsa-miR-195；mmu-miR-195

(6)确定命名规则之前发觉miRNA，如let-7，则保留原来名字。miRNA-miRNAduplexMicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第22页GENOMICORGANIZATIONOFMIRNAGENESIntronicmiRNAsofteninantisensedirection,madefromownpromoterExonicmiRNAs-non-coding(orinalternativelysplicedexons)MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第23页

在细胞增殖、分化、代谢、凋亡与发育过程中发挥主要调整作用。比如:1.由lin-4和let-7编码miRNA在线虫中控制了细胞分化和增殖时序；2.miR-430参加了斑马鱼大脑发育；3.miR-181控制哺乳动物血细胞分化为B细胞；4.miR-375调整哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌；5.miR-143在脂肪细胞分化起作用；

microRNA生理功效MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第24页

有些miRNA含有类似抑癌基因功效，经过转录后负性调控致瘤性靶基因表示而发挥生物学功效；有些miRNA含有类似癌基因作用，经过下调抑瘤性靶基因表示而发挥功效。

恶性肿瘤microRNA结构与表示异常

恶性肿瘤相关性microRNA

假如组织中某种或一些miRNA表示失常，细胞内许多起主要作用瘤基因或抑瘤基因就会受到异常调控而表示失常，从而造成肿瘤发生

。MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第25页原癌基因与抑癌基因原癌基因（proto-oncogene）

癌基因(oncogene)Myc抑癌基因(cancersuppressorgene)p53MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第26页miR-21

（1）miR-21在乳腺癌、肝癌、脑瘤等各种恶性肿瘤中表示显著上调，并与乳腺癌等肿瘤恶性分级呈正相关；（2）miR-21可能经过抑制其靶基因TPM1(tropomyosin1)表示而促进胶质瘤细胞增殖。（3）miR-21经过负调控抑癌基因PTEN表示，促进肝癌细胞增殖和侵袭能力。（4）经过抑制PCD4(programmedcelldeath4)mRNA翻译效率，抑制MCF-7增殖。（一）致瘤性microRNA（onco-miRNA）

在microRNA(miRNA)家族中，有些miRNA含有类似癌基因功效，与肿瘤发生呈正相关，这部分miRNA称为致瘤性miRNA（onco-miRNA），其过表示或连续活化将直接造成肿瘤发生发展。MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第27页let-7家族(1)Let-7是年由Reinhart等在线虫中发觉一个含有转录后调节作用miRNA，经过转录后调整lin-47和lin-51表示而控制线虫向成虫转变。(2)Ras是Let-7直接靶基因，受到let-7家族负性调控。Ras是一个膜相关GTPase信号蛋白，含有调整细胞生长、分化功效，是一个主要瘤基因。(3)在肺癌、乳腺癌、子宫癌等恶性肿瘤中，let-7家族与这些肿瘤相关脆性位点亲密相关，在肺癌中其表示下调，是一个与肺癌预后负相关抑癌基因。（二）抑瘤性microRNA(suppressormiRNA)

在miRNA家族中，有些miRNA含有类似抑癌基因功效，与肿瘤发生呈负相关，称为抑癌性miRNA（suppressormiRNA）。抑癌性miRNA表示下降或者缺失，将直接造成肿瘤形成。

MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第28页29

miRNA与肿瘤发生关系存在两种可能模式[Caldas,etal.（NatureMedicine）]：1、若miRNA表示上调，其对应抑癌基因表示下调时，则可能造成肿瘤发生；2、若miRNA表示下调，其对应癌基因表示上调时，一样可能造成肿瘤发生。MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第29页CANCER-RELATEDMIRNAS举例Cancer-relatedmiRNACancertypeReferencesmiR-17-92

cluster,let-7LungcancerMartinetal.,,Yanaiharaeta.,Takamizawaetal.,miR-10b,miR-21,miR-125b,miR-145,miR-155BreastcancerIorioetal.,,Sietal.,miR-18,miR-122a,miR-224,miR-199a,miR-199a*LivercancerMurakamietal.,,Mengetal.,,Gramantierietal.,miR-195,miR-125a,miR-200a,miR15,miR-16B-CLLCalinetal.,Calinetal.MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第30页四、恶性肿瘤microRNA转录调控异常（转录因子-microRNA-靶基因”交互作用分子网一）“络1．转录因子对microRNA初级转录产物调控2.microRNA对靶基因调控

大部分miRNA含有自己一套独立顺式作用元件（开启子和增强子序列），受到上游一系列转录因子调控。类似于蛋白编码基因转录过程，这些转录因子经过与miRNA顺式作用元件结合，调整miRNA在转录水平表示。miRNAs与其靶基因3’-UTR结合位点并不是完全互补，能够存在短错配和G-U配对，所以，miRNA调控多个靶基因。同时，同一个靶基因又同时受到多个miRNA调控。miR-21→TPM1、PCD4和PTEN；miR-15，miR-16，miR-181和miR-195→bcl-2MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第31页

所以，一个转录因子能够调控多个miRNA分子，一个miRNA分子又同时受到多个转录因子调控；同时，一个miRNA分子能调控多个靶基因，而一个靶基因又同时受到多个miRNA分子协同调控；它们之间组成了错综复杂调控网络，实现了对人体生命活动以及疾病发生发展和转归过程精细调控。3．“转录因子-microRNA-靶基因”组成复杂分子网络MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第32页microRNA与肿瘤诊疗和治疗肿瘤分子诊疗与治疗是分子医学主要组成部分，已成为当前肿瘤研究领域热点。一些含有主要诊疗和治疗价值分子标志物已经在临床上得到了广泛应用，但因为特异性、敏感性或靶向性等方面原因，其临床应用依然受到很大局限。因为miRNA在肿瘤多阶段发生过程中含有独特表示特征和生物学功效，miRNA在肿瘤分子诊疗和治疗中含有广泛应用前景。MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第33页恶性肿瘤增加检测肿瘤标识物(无形肿瘤)Tumormass1µg10³

1mg1061g109

10-100g1010-11

1kg1012临床可检测肿瘤肿瘤增加TumorcellsLeadtimeMicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第34页一、microRNA与肿瘤诊疗(一)肿瘤组织特异性表示标志物miRNA表示特征来对肿瘤进行分类，而且筛选能对肿瘤进行预后评定miRNA标识。Lu等经过对各种组织起源肿瘤组织miRNA（约200个）表示谱进行归类，发觉这些结果与肿瘤组织胚胎起源一致。比如，内皮起源肿瘤，如直肠癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等被分成一类，血液系统起源也被归为一类。而16000个蛋白编码基因mRNA则不能将其聚在同一类。所以，肿瘤miRNA表示特征反应了其发育起源，这也与miRNAs指导组织特异性发育功效相一致。1.肿瘤miRNA表示特征反应了其发育起源MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第35页许多研究经过miRNA芯片技术系统研究了miRNA在胃癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、白血病等肿瘤组织与其正常组织中差异表示，构建了对应肿瘤组织与正常组织差异miRNA表示谱，筛选出了一些含有临床诊疗价值分子靶标。如，miR-221、miR-301和miR-376a诊疗胰腺癌。(2)miRNA指导临床肿瘤诊疗（3）miRNA非常稳定福尔马林固定石蜡包埋样品中分离出来，这使得miRNA表示谱特征库建立成为可能。MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第36页(二)肿瘤血清标志物血清取得相对比较简单、对病人创伤少，所以肿瘤血清标志物越来越受到广大医学研究者青睐。（1）miRNA在血浆和血清中非常稳定，它们被有效保护以防止接触RNases，在严酷环境条件下仍能保持稳定。（2）miRNA在血浆和血清中稳定性使得其实际值与在病人身上得到测试值非常吻合。第一个被发觉血清miRNA标志物是miR-21。Lawrie等人证实，弥漫性大B细胞淋巴瘤病人血清miR-21水平很高，与淋巴瘤存活率呈负相关，是一个淋巴瘤预后预测理想分子靶标。MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第37页血清miRNA与肿瘤Cellresearch,MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第38页二、microRNA与肿瘤治疗（1）microRNA(miRNA)含有主要生物学功效，参加肿瘤发生发展；（2）miRNA序列短，操控简单，基因药品轻易导入到宿主体内，从而逆转肿瘤恶性生物学行为，到达治疗肿瘤目标。（3）依据miRNA生物学功效，能够从癌基因和抑癌基因角度设计针对性药品对肿瘤进行治疗。

MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第39页

针对致瘤性miRNA设计药品：人工合成反义寡聚核苷酸----抗miRNA寡聚核苷酸（AMOs）在灭活含有癌基因特征miRNA表示，逆转肿瘤细胞恶性生物学行为等方面取得了很大突破。动物试验结果表明，与胆固醇偶联AMOs注射小鼠后，能够在小鼠不一样器官有效抑制靶miRNA活性，抑制肿瘤生长和恶性生物学行为。针对抑瘤性miRNA设计药品：利用病毒或者脂质体能够瞬时引入大量含有抑瘤基因

miRNA（如let-7家族）。这些技术能够确保在一些组织特异性开启子控制之下，表示pre-miRNA及其两侧序列，而且刺激内源性miRNA加工，产生正确miRNA，抑制特定基因表示。生物企业针对miR-21治疗肺癌。MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第40页ACASESTUDYTherapeuticmicroRNADeliverySuppressesTumorigenesisinaMurineLiverCancerModelCell137,1005–1017,June12,MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第41页MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第42页MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第43页MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第44页MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第45页MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第46页MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第47页(一)miRNA基因克隆和判定1．直接克隆法

该方法经过建立富集miRNAcDNA文库，进行测序及序列分析，排除已知序列后，剩下新序列去检索基因组数据库，并用mFold软件分析其是否有发夹结构前体。最终经过Northern印迹对其进行判定。microRNA研究方法miR-124aisrestrictedtothebrainandspinalcordinfishandmouseortotheventralnervecordinflymiR-1isrestrictedtothemusclesandtheheartinmouseMicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第48页2．建立在突变表型基础之上正向遗传学筛选

正向遗传学遵照是从突变体表型分析到基因功效认识思维方式，它首先关注是含有某种缺点突变体。在得到了这么一个突变体之后，能够对其中突变基因进行定位和克隆。缺点：

①筛选miRNA效率低；

②miRNA单个缺失或突变只带来微小表型差异甚至没有表型差异造成许多miRNA被遗漏。案例：

①果蝇中bantam、miR-14、miR-278和线虫中lsy-6均是经过这种方法判定出来。MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第49页3．生物信息学分析miRNA是从含有发夹结构前体加工而来，而且有些miRNA序列或其前体序列在进化上比较保守。这些特点组成了生物信息学筛选miRNA基因基础。依据一些miRNA基因保守结构特点为基础设计计算机程序，扫描基因组序列以判定潜在miRNA基因。优点：①提升了miRNA判定速度和效率；②预计不一样物种中miRNA种类总数；③需要经过试验验证。MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第50页（二）miRNA表示规律研究1.miRNA芯片技术

将当前已经克隆miRNA或潜在miRNA制备成探针固定在尼龙膜或其它固相支持物上，然后与不一样组别总RNA或细胞器RNA杂交，经过信号强弱比较探讨miRNA表示情况。该方法类似于基因芯片技术，含有高通量、快速等优点，是当前疾病相关miRNA筛选惯用一个技术。qRT-PCRNorthernBlot原位杂交技术等RNA-seqMicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第51页52miRNA芯片是当前筛选和研究miRNA调控高通量伎俩MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第52页RNA-SEQ是另一个高通量研究方法RNA-Seq:arevolutionarytoolforTranscriptomics，Nature,,10:57MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第53页MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第54页MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第55页MIRBASE

HTTP://WWW.MIRBASE.ORG/MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第56页MIRVIEWERHTTP://PEOPLE.CSAIL.MIT.EDU/AKIEZUN/MIRVIEWER

MicroRNA与肿瘤专题知识专家讲座第57页REFERENCESRoleofmiRNAsinCancerandApoptosisLynan-LennonBiolRevCambPhilosSoc.Feb;84(1):55-71CausesandconsequencesofmicroRNAdysregulationincancerCroceNatRevGenet.Oct;10(10):704-14.miRNAsasoncogenesandtumorsuppressors.ZhangDevBio