GB/T 41699-2022 兽用生物制品外源支原体检验方法（正式版）

ICSCCS兽用生物制品外源支原体检验方法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T41699—2022本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会(SAC/TC374)提出并归口。本文件起草单位：中国兽医药品监察所。ⅡGB/T41699—2022当前我国兽用活疫苗制品的支原体检验方法存在检测周期长、检测结果受培养基质量影响较大等术研究制定了支原体检测聚合酶链式反应(PCR)的检验方法，并对支原体检验培养法进行了改进。本文件的制定可以规范我国兽用生物制品的生产和检验中的支原体检验。1GB/T41699—2022兽用生物制品外源支原体检验方法1范围合判定。本文件适用于兽用生物制品中外源支原体的检验。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3.1注：支原体是能在人工培养基上独立生长繁殖的结构最简单的微生物，能通过细菌滤器，是引起兽用生物制品污染的重要微生物。3.216SrRNA基因16SrRNA细菌细胞内编码rRNA相对应的DNA序列。4原理通过物理和化学方法使样品脱氧核糖核酸(DNA)从各组分中分离出来，利用苯酚、三氯甲烷(氯获得纯化的DNA。对现有已公布支原体种类的16SrRNA基因序列进行分析，设计能够检测支原体及5支原体检验聚合酶链式反应(PCR)法5.1试剂和材料5.1.2苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1,体积比):配制按照A.1的方法。5.1.3电泳缓冲液(TAE):配制按照A.2的方法。2GB/T41699—20225.1.4Tris-EDTA缓冲液(TE缓冲液，pH8.0):配制按照A.3的方法。5.1.56倍浓缩样品缓冲液：配制按照A.4的方法。5.1.60.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS):配制按照A.5的方法。5.1.71.0%琼脂糖凝胶：配制按照A.6的方法。5.1.8细菌DNA提取试剂盒，选用前应对其核酸提取能力进行试验验证。5.1.9DNA聚合酶(taq)及配套缓冲液(10×Buffer)或DNA聚合酶预混液(TaqMix)。5.1.10DNA标准分子量Marker:能够清楚地区分50bp～1000bpDNA片段。脱氧核糖核苷酸等体积混合或直接购买市售dNTPs混合溶液。5.1.13支原体检验阳性对照：支原体种类应符合B.2。5.2仪器设备5.2.1高速台式离心机，最高可达12000g。5.2.2聚合酶链式反应(PCR)仪。5.2.3生物安全柜。5.2.4核酸电泳仪。5.2.5小型电泳槽。5.2.6凝胶成像仪。5.3样品DNA的抽提与纯化样品的DNA提取可采用酚氯仿抽提法(5.3.2)、细菌DNA提取试剂盒法(5.3.3)和简易提取法(5.3.4),其中简易提取法只适用于冻干样品。阳性对照样品和阴性对照样品的DNA提取应与待检样品的DNA提取方法一致。加入0.5mL平衡酚(5.1.1),颠倒振摇2min后8000g离心2min,取上清加入0.5mL苯酚：氯仿：异戊醇(5.1.2),颠倒振摇2min后10000g离心5min取上清约0.8mL,加入等体积的异丙醇混匀，置-15℃以下沉淀1h,10000g离心10min弃上清，加入1.0mL75%乙醇洗涤一次后晾干，加入去离子水50μL溶解DNA,置—15℃以下冻存。5.3.3细菌DNA提取试剂盒法选择经验证的市售商品化细菌DNA提取试剂盒(5.1.8),取1.0mL样品经10000g离心10min3GB/T41699—20225.4试验步骤将各反应小管、阴性对照管和阳性对照管标记后，按照表1所列的反应体系添加样品DNA模板仪(5.2.2)内，设定热盖温度98℃~102℃,95℃预变性5min后，94℃/30s,56℃/30s,72℃/40s,共单位为微升试剂体积普通聚合酶链式反应(PCR)试剂TaqMix类聚合酶链式反应(PCR)试剂DNA模板(5.3)10pmol/L上游引物MF1(5.1.12)10μmol/L上游引物MF2(5.1.10μmol/L下游引物MR(5.1.1超纯水总体积5.4.2.1将1.0%琼脂糖凝胶(5.1.7)加热熔化，灌入配套的制胶板中。在电泳槽(5.2.5)中加TAE(5.1.3),并将凝胶置入电泳槽的电泳区域，补加电泳液至凝胶刚刚没入电泳液。5.4.2.3调整电泳仪(5.2.4),以2V/cm～5V/cm电压电泳30min～40min。5.4.2.4用紫外凝胶成像仪(5.2.6)扫描并保存图片文件，通过与DNA标准分子量Marker(5.1.10)对阴性对照应无特异性扩增条带，阳性对照样品应得到396bp～413bp的特异性扩增条带，表明聚5.5.2.1样品检测结果出现396bp～413bp的特异性扩增条带，表述为试样检测结果为支原体检验聚合酶链式反应(PCR)法阳性。4GB/T41699—20225.5.2.2样品检测结果未出现396bp～413bp的特异性扩增条带，表述为试样检测结果为支原体检验聚合酶链式反应(PCR)法阴性。6支原体检验培养法6.1.2改良Frey氏液体培养基：配制按照B.3的方法。6.1.3改良Frey氏固体培养基：配制按照B.4的方法。6.1.5支原体固体培养基：配制按照B.6的方法。6.2.1恒温培养箱(35℃~37℃)。6.2.2生物安全柜。6.3检验用培养基的选择固体培养基进行检验。在生物安全柜(6.2.2)内，取1.0mL生物制品样品或复溶样品接种到含20mL支原体液体培养基(1.0cm×10.0cm)中，0.2mL/支，将小瓶与小管置35℃~37℃培养箱(6.2.1)内培养，分别于接种后5d、10d、15d再从小瓶中取0.4mL培养物移植到2支含1.8mL支原体液体培养基的小管内，后停止观察。观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，在原pH变化达±0.5时，立即将小瓶中的培养物移植到小管液体培养基和固体培养基(6.1.3或6.1.5),观察液体培养基中是否出现恒定的pH变化及固体上有无典型的支原体菌落。在每次液体培养基移植小管培养的同时，取培养物0.1mL～0.2mL接种固体培养基(6.1.3或6.1.5),置含5%～10%(体积分数)二氧化碳、相对湿度(70±10)%,35℃~37℃的CO₂培养箱(6.2.3)内阳性对照使用阳性对照支原体(6.1.1)培养物按照6.5.15GB/T41699—2022对照。阳性对照中至少有一个固体培养基平板出现支原体菌落，且阴性对照应无支原体生长，则检验有原体检验培养法阳性。检验培养法阴性。7综合判定7.1当聚合酶链式反应(PCR)法结果为阴性时，判定试样检测结果为支原体检验阴性。必要时，采用培养法进行验证。7.2当聚合酶链式反应(PCR)法结果为阳性，培养法结果为阳性时，判定试样检测结果为支原体检验7.3当聚合酶链式反应(PCR)法结果为阳性，培养法结果为阴性时，判定试样检测结果为支原体检验6GB/T41699—2022(规范性)常用试剂的配制A.1苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1,体积比)A.1.1.1取出固体酚，使其温度升至室温，然后在68℃使酚溶解，加入羟基喹啉至终质量分数为地移出上层水相液。A.1.1.3加等体积的0.1mol/LTris·Cl(pH8.0)到酚中，搅拌15min,然后按A.1.1.2所述移出水相液。重复抽提，直到酚相pH大于7.8。酚达平衡后，加入1/10体积含有0.2%(体积分数)巯基乙醇的A.1.2苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1,体积比)异戊醇后混匀，加入1/10体积含有0.2%巯基乙醇的0.1mol/LTris·Cl(pH8.0)覆盖，在2℃~8℃避光保存3个月。A.2电泳缓冲液(TAE)A.2.10.5mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0):取EDTA18.61g溶于80mL超纯水中，完全溶解后，用氢氧化钠调pH至8.0,定容至100mL。和100mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0),充分溶解后，定容至1000mL。室温保存3个月。使用时用超纯水对50×TAE缓冲液进行50倍稀释，即为TAE缓冲液。A.3Tris-EDTA缓冲液(TE,pH8.0)分别量取10mL1mol/LTris·Cl溶液(pH8.0)和2mL0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0),加超纯水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min,2℃~8℃保存6个月。A.4样品缓冲液(6倍)存6个月。A.50.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2)A.5.1A液：0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液，称取NaH₂PO₄·H₂OA.5.2B液：0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液，称取Na₂H27.6g,溶于超纯水中，定容至71.6g,或Na₂HPO₄·2H₂O35.67GB/T41699—2022溶解后用超纯水定容至1000mL备用。室温保存6个月。称取琼脂糖1.0g溶于0.5×TAE缓冲液100mL,置微波炉中加热至完全溶解后，冷却至50℃~60℃,加入溴化乙锭(EB)溶液或Goldview核酸染料5μL,摇匀后倒入电泳板，凝固后取下梳子，备用。室温密闭保存1个月。A.725%酵母浸出液称取250g鲜酵母，加入到1000mL超纯水中，搅拌至混悬液，加热至80℃~90℃并保持温度30min,冷却后6000g离心10min,取上清，过滤除菌后分装，置2℃~8℃保存6个月。8GB/T41699—2022(规范性)B.1支原体检验通用引物表B.1聚合酶链式反应(PCR)引物序列及目的片段长度引物名称引物序列扩增产物长度/bp目的基因名称MF15'-GCAAARCTATRGARAYATAGYVGAG-3'#396～413MF25'-GCAAAGGCTTAGAAATAAGTTCGGAG-3'MR5'-CCARCTCYCATRGTKTGACGG-3'”两条引物序列中均含有兼并碱基，其中R=G/A、Y=C/T、V=A/C/G、K=T/G。支原体检验阳性对照用支原体种类见表B.2,聚合酶链式反应(PCR)阳性对照可选表中任意一种灭活后的支原体培养物。培养法阳性对照，根据样品类型选择支原体种类。表B.2支原体检验阳性对照用支原体种类对照支原体名称CVCC菌种编号ATCC菌种编号对应的培养基鸡滑液支原体CVCC2960改良Frey氏液体培养基改良Frey氏固体培养基猪鼻支原体CVCC361ATCC17981支原体液体培养基支原体固体培养基B.3改良Frey氏液体培养基改良Frey氏液体培养基的配方见表B.3。序号成分添加量1氯化钠2氯化钾3硫酸镁(含7个结晶水)4磷酸氢二钠(含12个结晶水)5无水磷酸二氢钠6葡萄糖(含1个结晶水)9GB/T41699—2022序号成分添加量7乳蛋白水解物8酵母浸出粉(或25%酵母浸出液)5.0g(或100.0mL)91%L-半胱氨酸2%精氨酸1%酚红溶液8万单位/mL青霉素猪(或马)血清超纯水加至980.0mL至1000.0mL,过滤除菌，定量分装，置2℃~8℃保存不超过6个月或—15℃以下保存不超过12个月。B.4改良Frey氏固体培养基改良Frey氏固体培养基辅助成分的配方见表B.4。序号成分添加量1猪(或马)血清2341%L-半胱氨酸58万单位/mL青霉素改良Frey氏固体培养基基础成分的配方见表B.5。序号成分添加量1氯化钠2氯化钾GB/T41699—2022表B.5改良Frey氏固体培养基基础成分的配方(续)序号成分添加量3硫酸镁(含7个结晶水)4磷酸氢二钠(含12个结晶水)5无水磷酸二氢钠6葡萄糖(含1个结晶水)7乳蛋白水解物8酵母浸出粉(或25%酵母浸出液)5.0g(或100.0mL)9琼脂超纯水840.0mL(或740.0mL)将表B.5各成分充分溶解、混合后，用1.0mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.6～7.8,用超纯水定容至850.0mL,加热使琼脂