分子医学与分子医学技术专家讲座

分子医学与分子医学技术周俊宜

基础医学院生化教研室分子医学与分子医学技术第1页分子医学概述分子医学与分子医学技术第2页生命螺旋分子医学与分子医学技术第3页

从基因角度重新认识疾病，利用基因技术预防和治疗疾病、判定身份，器官再造，利用基因技术预防新生儿疾病甚至设计愈加“完美”新生儿，培育新动植物品种……即使当前基因技术大多数尚待完善，其发展和应用前景却未可限量，这使人们看到了能够拥有一个愈加美好世界可能性。但另首先，伴随基因技术日益深入、广泛地干预生命，许多人也产生了很多忧虑，从伦理、道德、法律、社会角度来重新审阅基因技术应用。

分子医学分子医学与分子医学技术第4页1994年2月，美国国立卫生研究院((NIH)卡普((Karp),布罗德((Broder)《癌研究》

“分子医学新方向”分子医学与分子医学技术第5页1994年9月,《Nature》杂志“分子医学研讨会”

“分子医学挑战”

分子医学与分子医学技术第6页1995年,美国《分子医学》杂志正式创刊

标志着当代生物医学进入分子医学新阶段

分子医学与分子医学技术第7页

依据卡普等定义，分子医学内容包含:发觉控制正常细胞行为基本分子

搞清基因异常与疾病发生关系

经过检验和纠正这些异常基因对疾病进行诊疗、治疗和预防

分子医学与传统医学主要不一样在于前者对疾病认识和操作都是在分子和基因水平上进行。

分子医学与分子医学技术第8页分子医学基本内容:疾病分子机理

疾病基因诊疗

疾病基因治疗

疾病基因预防

分子医学社会、伦理问题

分子医学与分子医学技术第9页

探索疾病原因，是有效治疗疾病前提。当前，医学对一些还缺乏有效治疗方法，就是因为对病因缺乏深入认识。基因科学发展，为人类从细胞内部微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新思绪。疾病分子机理分子医学与分子医学技术第10页

维多利亚女王与尼古拉二世分子医学与分子医学技术第11页英国女王维多利亚。她带有血友病基因，并将其传给了她儿女。血友病是一个遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小伤口而出血不止造成死亡。血友病在女性普通表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持一次欧洲王室组员集会，与会者有17人是她后代，其中有她孙女亚历山德拉（21），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，造成他们儿子患有血友病。

分子医学与分子医学技术第12页

1949年波林发觉镰刀型细胞贫血症（病人红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。

分子医学与分子医学技术第13页

美国毕晓普和瓦慕斯等人研究表明：动物体内癌基因不是来自病毒，而是因为在动物正常细胞基因中原来就存在一个庞大癌基因族，正常情况下这些原癌基因是不活跃，但当受到病毒入侵或碰到物理、化学等原因作用时，就可能被激活，突变为癌基因。这也就解释了化学污染、吸烟、放射线辐射等原因致癌原因。

分子医学与分子医学技术第14页

疾病基因诊疗

从广义上讲，大多数疾病都能够从遗传物质改变中寻找出原因。而从技术上看，只要找到了与疾病相关基因，基因诊疗便马上能够实现。伴随“人类基因组计划”进程，将大大加紧疾病相关基因发觉与克隆，基因诊疗将成为疾病诊疗常规方法。

单基因疾病诊疗：普通可在临床症状出现之前作出诊疗，不依赖临床表型；有遗传倾向疾病：易感基因筛查，如高血压，冠心病，肥胖等。

外源性病源体：如病毒、细菌、寄生虫等引发传染病，

分子医学与分子医学技术第15页

美国前副总统汉弗莱<Humphrey)在1967年发觉膀胱内有一肿物，病理切片未发觉癌细胞良性“慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。九年后，他被诊疗为患有“膀胧癌”，两年后死于该病。

分子医学与分子医学技术第16页

1994年，研究者用灵敏PCR技术对上述汉弗莱1967年病理切片进行了P53抑癌基因检验，发觉那时组织细胞即使在形态上还没有表现出恶性改变，但其P53基因第227个密码子已经发生了一个核苷酸突变。就是这个基因微小改变，使其抑癌功效受损，造成九年后细胞癌变发生。这说明，在经典症状出现之前很长时间，细胞癌变信息已经在基因上表现出来了分子医学与分子医学技术第17页基因判定技术

人体细胞有总数约为30亿个碱基正确DNA，每个人DNA都不完全相同，人与人之间不一样碱基对数目达几百万之多，所以经过分子生物学方法显示DNA图谱也因人而异，由此能够识别不一样人。所谓“DNA指纹”，就是把DNA作为像指纹那样独特特征来识别不一样人。因为DNA是遗传物质，所以经过对DNA判定还能够判断两个人之间亲缘关系。DNA判定技术是英国遗传学家A·J·杰弗里斯（1950－）在1984年创造。因为人体各部位细胞都有相同DNA，所以能够经过检验血迹、毛发、唾液等判明身分。分子医学与分子医学技术第18页

DNA指纹

只要罪犯在案发觉场留下任何与身体相关东西，比如血迹和毛发，警方就能够依据这些蛛丝马迹将其擒获，准确率非常高。DNA判定技术在破获强奸和暴力犯罪时尤其有效，因为在这类案件中，罪犯很轻易留下包含DNA信息罪证。依据DNA指纹破案即使准确率高，但也有犯错可能，因为两个人DNA指纹在测试区域内有完全吻合可能。所以在英国将DNA指纹测试扩展到10个区域，使偶然吻合危险几率降到十亿分之一。分子医学与分子医学技术第19页分子医学与分子医学技术第20页基因疗法，即是经过基因水平操作来治疗疾病方法。当前基因疗法是先从患者身上取出一些细胞（如造血干细胞、纤维干细胞、肝细胞、癌细胞等），然后利用对人体无害病毒当载体，把正常基因嫁接到病毒上，再用这些病毒去感染取出人体细胞，让它们把正常基因插进细胞染色体中，使人体细胞就能够“取得”正常基因，以取代原有异常基因；接着把这些修复好细胞培养、繁殖到一定数量后，送回患者体内，这些细胞就会发挥“医生”功效，把疾病治好了。疾病基因治疗分子医学与分子医学技术第21页

一个外科庸医正在从一个痴呆精神病患者头上取出“愚人之石”，该画是16世纪博希所画，以讽刺那个时代人们无知。但在基因时代，假如真能取出致病基因，那么这名患者可能就有救了。分子医学与分子医学技术第22页

美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功范例。1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩因为遗传基因有缺点，本身不能生产ADA，先天性免疫功效不全，只能生活在无菌隔离帐里。他们将含有这个女孩自己白血球溶液输入她左臂一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺点基因已经被健康基因所替换。在以后10个月内她又接收了7次这么治疗，同时也接收酶治疗。经治疗后，免疫功效日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人生活。

谢德尔，1999分子医学与分子医学技术第23页分子医学与分子医学技术第24页

1990年沃尔夫（WOff）等发觉，将带有甲型流感病毒核蛋白编码基因质粒注射到小鼠肌肉内，可使小鼠能经受致死剂量甲型流感病毒攻击。这种裸露DNA经过滴鼻和肠道也能够进人细胞，并取得成功保护性免疫。这种含有疫苗作用裸露DNA称之为“基因疫苗”（genevaccine）。

疾病基因预防分子医学与分子医学技术第25页

基因疫苗不但可用于病毒感染，还可用于防治肿瘤，其主要优点为能够诱导很有效专一性T杀伤性细胞，后者能够杀死肿瘤细胞。基因疫苗安全性极高，一是无直接副作用，二是无间接副作用，不存在对人体毒性，机体耐受性好，输注疫苗不引发其它疾患。1995年4月，经美国FDA同意进行了首例应用基因疫苗人体临床试验。因而，能够看到其实际应用已指日可待了。分子医学与分子医学技术第26页爱滋病基因疫苗

分子医学与分子医学技术第27页时钟基因与抗衰老

人类从公元35前就开始寻找长生不老药。老化原因有各种原因，如蛋白质损伤、DNA损伤、细胞膜损伤、细胞内积累废弃物、端粒缩短等。提升寿命上限目标能够经过各种方法实现，除了治疗疾病、均衡营养、降低环境污染、适量运动等方法外，发掘控制衰老或长寿基因成为最有潜力路径之一。分子医学与分子医学技术第28页

“时钟基因”：

破坏“时钟1基因”（clock1gene）可使线虫寿命延长1.5倍。科学家们发觉，人类也有与时钟1基因大致相同基因。

“年纪1基因”（age1）、“daf-2”等受损会延长寿命基因。人类DNA中原来就有负责化解活性氧毒性基因，我们也能够采取活化该基因方法，以预防老化。热量限制能够延长包含哺乳动物在内许多物种动物生命周期。限制热量摄入而延长生命现象与一个叫作SIR2基因相关。

“我还活着”基因一旦发生改变，就会使果蝇寿命延长一倍。人体内也存在这种基因，它是经过改变新陈代谢来发挥作用。分子医学与分子医学技术第29页

DNA缠绕成染色体末端，有称做端粒（telomere）区域。控制着细胞分裂次数，端粒伴随细胞分裂每次变短，短到某个程度，细胞将不再分裂。人一生中，细胞大约能分裂50～60次。所以端粒是控制生理寿命生物钟，而端粒长短就成为表示细胞“年纪”指标。假如加入一个“端粒酶”阻止它缩短，就可使细胞保持年轻，人就像吃了“唐僧肉”一样实现长生不老梦想。

分子医学与分子医学技术第30页

分子医学与分子医学技术第31页

分子医学与传统医学最根本区分在于前者可在基因水平上对疾病进行操作。对遗传物质操作可能引发后果一开始就是科学界和公众关注问题。早在70年代初，基因重组技术刚开始出现时候，以美国著名分子生物学家伯格（Berg）为首11名科学家共同呼吁禁止开展基因工程研究，并得到了美国国立卫生研究院赞同。

分子医学社会、伦理问题分子医学与分子医学技术第32页

科学家们对自己研究工作可能产生严重后果公开唤起公众注意，这在科学史上还是第一次，说明科学家对遗传物质操作所取态度是极其慎重。在那以后，利用基因工程技术在大肠杆茵中生产预定蛋白质分子被证实是无害可行，因而在80年代以来得到了快速发展，但将基因操作直接应用于人类疾病治疗则与普通基因工程不可同日而语。

分子医学与分子医学技术第33页分子医学惯用技术分子医学与分子医学技术第34页分子医学与分子医学技术第35页分子医学与分子医学技术第36页基因获取基因检测基因重组基因表示基因标识基因探测基因转移基因信息分子医学与分子医学技术第37页基因获取分子医学与分子医学技术第38页

获取目标基因经常是基因操作首要步骤。常规方法有PCR法，基因文库或cDNA文库法以及化学合成法。应依据详细研究目标和试验条件选取适当方法。

分子医学与分子医学技术第39页化学合成法较短基因（60-80bp）用途：PCR引物测序引物定点突变核酸杂交探针分子医学与分子医学技术第40页基因文库限制性内切酶……克隆、转化、培养、判定基因组DNA基因文库分子医学与分子医学技术第41页分子医学与分子医学技术第42页引物引物3’5’5’5’PCR技术基因组分子医学与分子医学技术第43页分子医学与分子医学技术第44页引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布。（4）引物内部防止形成二级结构。（5）两引物间防止有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制分子医学与分子医学技术第45页PCR技术基本过程模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循环仪94oC5’94℃55℃72℃分子医学与分子医学技术第46页加样孔电泳图谱PCRPT-PCRDNAMarker分子医学与分子医学技术第47页基因检测分子医学与分子医学技术第48页

对一个基因或一段DNA片段进行检测判定是分子医学技术中最惯用到伎俩。包含电泳检测、序列分析、分光光度分析等方法。分子医学与分子医学技术第49页DNA分子电泳检测电泳条带加样孔分子医学与分子医学技术第50页凝胶浓度与DNA片段大小电压、电流与分辨率电泳缓冲液、上样缓冲液电泳时间与环境温度凝胶板制备分子医学与分子医学技术第51页

法国VL凝胶成像系统分子医学与分子医学技术第52页核酸定量和纯度分析共轭双键：对260nm波长紫外光有较强吸收。消光系数波长220240260280300

分子医学与分子医学技术第53页BECKMANDU800核酸蛋白检测仪

分子医学与分子医学技术第54页DNA序列检测分子医学与分子医学技术第55页基因重组与基因工程分子医学与分子医学技术第56页

基因重组技术作为分子医学中最主要、最基本技术之一，是许多分子医学试验实施基础，在基因诊疗、治疗和预防中含有举足轻重意义。分子医学与分子医学技术第57页分子医学与分子医学技术第58页

当代基因工程创始人P·伯格（美国,1926－）在1960年以敏锐科学预见力提出一个大胆构想：是否能够创造出一个人工方法，把外界遗传基因引入动物体内，以到达改变遗传性状和治疗一些疾病需要呢？1972年，伯格把两种病毒DNA用同一个限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一个新重组DNA分子，首次实现两种不一样生物DNA体外连接，取得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术诞生。伯格所以取得了1980年诺贝尔化学奖。分子医学与分子医学技术第59页1973年，美国斯坦福大学教授S·科恩和加州大学旧金山分校教授H·W·博耶将两个不一样质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药品，而且这种大肠杆菌后代都含有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌细胞分裂时也能自我复制。分子医学与分子医学技术第60页

科恩随即以DNA重组技术创造人身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程技术专利。这标志着自然界不一样物种间在亿万年中形成天然屏障被打破了，人类能够依据自己意愿定向地改造生物遗传特征，甚至创造新生命类型。1977年，吉尔伯特（W·Gilbert）分别将编码胰岛素和干扰素DNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。

分子医学与分子医学技术第61页

基因工程问世后短短30年间，不但催生了一个又一个基因工程新结果，也催生了一个源于DNA研究新兴产业，造成众多生命科学高技术企业应运而生。到年初，美国生物技术企业已经有1400家，而这一数字还不包含为数更多相关技术企业和传统制药企业，底美国生物技术产业收入到达250亿美元。能够毫不夸大地说，基因工程对生物、医药和农业等领域都产生了革命性影响，它对人们生活影响深度和广度早已超出了人们想象。

分子医学与分子医学技术第62页

淡绿、橘黄、浅红、金黄……用这些天然彩色蚕茧丝无需染色而织成色彩斑斓绸缎，兼具华美外观和环境保护内质。经过基因重组法选育高产彩色茧蚕品种获成功。分子医学与分子医学技术第63页

玫瑰栽培历史能够追溯到5000年前，但经过色素展现出蓝色玫瑰却从来没有过。从蓝色三叶草中提取制造蓝色色素基因，然后注入到玫瑰中，并成功地让翠雀花素单独显色。

分子医学与分子医学技术第64页

目标基因基因载体重组体分切接转筛总体技术路线分子医学与分子医学技术第65页分:

分子医学与分子医学技术第66页切:

限制性内切酶

“分子手术刀”

限制性酶活性缓冲液甲基化底物性状分子医学与分子医学技术第67页

“分子剪刀”发觉者分子医学与分子医学技术第68页接:

DNA连接酶

“分子针线”分子医学与分子医学技术第69页转:

分子医学与分子医学技术第70页筛:

基因载体宿主细胞克隆位点分子医学与分子医学技术第71页分子医学与分子医学技术第72页基因表达分子医学与分子医学技术第73页大肠杆菌SS蛋白重组体+SS基因分子医学与分子医学技术第74页1E.coli表示体系优势：一个成熟基因克隆表示受体细胞繁殖快速，培养代谢易于控制易于进行遗传操作和高效表示分子医学与分子医学技术第75页不足之处：1）缺乏适当转录后和翻译后加工机制。2）缺乏表示蛋白质复性系统，表示蛋白无特异性空间结构。3）表示产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。分子医学与分子医学技术第76页2目标基因高效表示三个原因：强化蛋白质生物合成抑制蛋白质降解恢复蛋白质空间构象分子医学与分子医学技术第77页3目标基因表示产物检测1）蛋白质PAGE对照样品Marker分子医学与分子医学技术第78页2）表示蛋白生物学功效检测淀粉酶基因表示分子医学与分子医学技术第79页4目标蛋白分离纯化分子筛亲和柱离子交换抗原抗体目标蛋白分子医学与分子医学技术第80页安玛西亚快速蛋白纯化仪（FPLC）

分子医学与分子医学技术第81页基因探测分子医学与分子医学技术第82页核酸标识：同位素标识非同位素标识核酸探针：探针是一段人工合成碱基序列，连接上一些可检测物质，依据碱基互补原理，利用探针到基因混合物中识别特定基因核酸杂交：探测基因所依据最基本理论就是核酸碱基互补标准，最惯用方法就是核酸分子杂交，它应用一段与目标基因碱基互补核酸作为探针去探测待测样品分子医学与分子医学技术第83页

分子医学与分子医学技术第84页DNA聚合酶Ⅰ

-32P-dNTPDNA缺口平移分子医学与分子医学技术第85页5’-CCCCAAOHCCCAACCCCAACCCCAAOHCCCAA3’3’-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT5’DNA聚合酶Ⅰ5‘3’聚合酶5‘3’外切酶5’5’分子医学与分子医学技术第86页5’-CCCCAACCC……3’-GTTGGG……末端标识物

-32P-dNTP5’-CCCCAACCC……3’-GGGGTTGGG……分子医学与分子医学技术第87页基因芯片（Genechip）

基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列。它高度集成成千上万网格状密集排列核酸分子（也叫分子探针）。基因芯片能快速破译人类基因组和检测基因突变，当前，该技术主要应用于基因表示检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。它出现给分子生物学、细胞生物学及医学领域带来新革命，成为后基因时代最主要基因功效分析技术之一。分子医学与分子医学技术第88页分子医学与分子医学技术第89页应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌相关基因表示分子医学与分子医学技术第90页DNA微点阵已广泛和流行用于疾病诊疗、基因组比较、以及新型癌症分类。分子医学与分子医学技术第91页基因转移分子医学与分子医学技术第92页

转基因生物是指用试验方法导入外源基因在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代一类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，取得了个体比对照组大一倍转基因“超级小鼠”以来，这项高新技术受到各国重视，发展快速，取得不少突破，全世界已申请工程动物专利到达80多项。

分子医学与分子医学技术第93页

囊性纤维变性是一个遗传病，患者体内会产生粘稠粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器官内部通道，大约有二分之一患者活不过31岁。英国PPT企业培育了植入人体基因克隆羊，羊奶中含有能够治疗囊性纤维变性人体蛋白。

维尔莫特所在研究所曾向德国一家药厂出售一头这么转基因羊，取得50万英镑。分子医学与分子医学技术第94页

“克隆”和“转基因”之间最大不一样是前者纹丝不动地保留了原来遗传性状，而后者则改变了原来遗传性状。“克隆”是无性繁殖，克隆动物是不经过生殖细胞而直接由体细胞取得新个体；而转基因动物和普通动物区分只在于在受精卵或胚胎干细胞中转入了另外基因。假如能将克隆技术和转基因技术结合起来话，可能能够在短时间内就得到许多一模一样拥有优良性状转基因动物。也就是说，转基因动物将不再是单个生产，而是批量生产。这对于制药或器官移植等领域来说是一个很有潜力发展方向分子医学与分子医学技术第95页

克隆羊“多利”分子医学与分子医学技术第96页分子医学与分子医学技术第97页基因测序与信息技术分子医学与分子医学技术第98页

基因测序是确定DNA双股链上每个独立结构单元或碱基确实切次序过程。测序经常被称为“破译”，因为其结果就像解码一样。解码结果包含数百页和成千上万行4种字母序列。这些字母表示4种不一样碱基，分别用它们首字母A、T、C、G表示，其排列次序中蕴藏着各种各样遗传信息和生命指令。生物信息学((bioinformation