分子病理学常用研究方法专家讲座

分子病理学惯用研究方法

(一)分子病理学常用研究方法第1页基因变异诊疗

分子病理学常用研究方法第2页Southernblot,

PCR,

RT-PCR,Real-TimeRT-PCR,

FISH分子遗传学异常检测方法分子病理学常用研究方法第3页检测基因丢失和扩增

比较基因组杂交ComparativeGenomicHybridization,CGH分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合优点：1.新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可进行CGH研究2.被测样品只需数mg甚至不到1mgDNA分子病理学常用研究方法第4页分子病理学常用研究方法第5页CGH应用：为搜寻肿瘤癌基因或抑癌基因确定范围肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数增加，往往提醒该位置可能包含已知或未知癌基因有扩增肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数降低或缺失，提醒该位置可能包含已知或未知抑癌基因丢失CGH发觉MYCN，MET与胃癌相关分子病理学常用研究方法第6页区分良恶性病变，临床上预计预后

16例前列腺癌CGH显示染色体异常占81%5例良性前列腺增生全部阴性

67肝细胞癌CGH显示:1q,8q,20q,17q↑4q,8p,13q,16q↓12例癌周肝硬化组织：阴性

53例淋巴结阴性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q异常，预后差

分子病理学常用研究方法第7页蛋白组学及生物芯片分子病理学常用研究方法第8页生物芯片（biochip)是指采取光导原位合成或微量点样等方法将大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、RNA）或多肽分子甚至细胞等生物样品有序地固定于支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）表面，组成密集二维分子排列，然后与已标识待测生物样品中靶分子杂交，经过特定仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子数量改变。

分子病理学常用研究方法第9页生物芯片：基因芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片基因芯片(Affymetrix专利）

寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因组芯片

DNAmicroarray:阵密度很高玻片基质或胶膜基质DNA微阵列DNAmacroarray:阵密度较低尼龙膜DNA微阵列

分子病理学常用研究方法第10页杂交组织化学-概述一、概述和原理

杂交组织/细胞化学(Hybridohistochemistry)

原位分子杂交(Insituhybridization,ISH)利用核酸分子间硷基互补性质结合免疫组织化学技术在组织切片(或细胞片)上显示特异核酸(DNA或RNA)序列一个技术。分子病理学常用研究方法第11页杂交组织化学原理标识探针杂交变性标识探针

──

互补核酸次序DNA/cDNADNADNA/cDNARNARNARNA分子病理学常用研究方法第12页核酸分子杂交种类：固相杂交(硝酸纤维素膜或尼龙膜)Southern印迹转移(DNA)Northern印迹转移(RNA)

液相杂交原位杂交原位杂交四要素：

适当探针良好组织材料可靠试剂和方法相当形态学基础分子病理学常用研究方法第13页二、探针制备1.探针种类和制备

DNA探针：应用多，操作轻易比较敏感，背景高(本身网络)双链DNA探针用时要变性

整合

转化扩增DNA片段───质粒(或其它载体)───细菌───

提取酶切───质粒───探针(PCR扩增)分子病理学常用研究方法第14页线性质粒提取质粒扩增探针重组质粒质粒酶切插入转染探针分子病理学常用研究方法第15页RNA探针：结合稳定，穿透性好无需变性，不存在退火问题未杂交探针可用RNase去除，背景好多采取体外转录法合成同时加以标识

寡核苷酸探针：合成快速，不用变性，对RNase不敏感30-150bp，组织通透性好未端标识，敏感度不够多采取DNA合成仪固相合成分子病理学常用研究方法第16页探针选择:特异性多项选择择基因组5'或3'端20-50对碱基互补就已稳定

大小200-300对碱基互补可获强复合体原位杂交多项选择择100-400bp(<1000bp)种类稳定性：RNA-RNA>DNA-RNA>DNA-DNA分子病理学常用研究方法第17页2.探针标识

标识物：同位素,非同位素,修饰物同位素：敏感，定位较差，试验室要求高

探针使用周期短

32P放射过强,定位差,半衰期短(14.3天)

35S最惯用,定位好,曝光时间短(数天),半衰期较长(84天)

125I与35S相同，但半衰期较短(60天)

3H惯用,放射能小,定位准确,曝光时间长(数周),半衰期长分子病理学常用研究方法第18页非同位素：定位很好，试验室要求低，可长久使用

生物素：最早用，特点与免疫组化相同地高辛：最惯用，敏感性高，特异性好荧光素：方法简便，敏感性低，多用于染色体检验

修饰物(现少用)：磺基化(Sulphon基团)乙酰氨基芴光敏生物素汞分子病理学常用研究方法第19页

标识方法

引入法：利用标识好核苷酸合成探针缺口翻译法随机引物法末端标识法PCR扩增标识法RNA体外合成法化学修饰法：化学修饰已合成探针分子病理学常用研究方法第20页缺口翻译/平移法：双链DNA标识，线环状均可分子较大(>1KB)者效果好DNA用量较多(>200ng)标识率低原理：DNA酶(DNaseI)在双链DNA分子中导入缺口DNA聚合酶(DNApolI，含有5'→3'外切酶和5'→3'聚合酶活性)，使各种核苷酸，包含标识核苷酸自缺口处合成与对应链互补DNA链(探针)变性后标识探针分子小，穿透性好分子病理学常用研究方法第21页缺口翻译/平移法分子病理学常用研究方法第22页随机引物法：单/双链线状DNA标识，100-500bp亦可DNA用量少(可少至10ng)标识率高(1/20-25)原理：以任意次序六核苷酸片段为引物与单链DNA模板结合后，在DNA聚合酶IKlenow片段(无5'-3'外切酶活性)作用下合成带标识核苷酸互补DNA链(探针)分子病理学常用研究方法第23页随机引物法分子病理学常用研究方法第24页1.于Eppendorf离心管中依次加入15μlddH2O1μgDNA(10ng-3μg)100℃10'(变性)干冰聚冷30秒钟2.加入10×六核苷酸混合物2μl10×dTNP标识混合液2μl

含1mMdATP，1mMdCTP，1mMdGTP，0.65mMdTTP，0.35mMDIG-dUTPKlenow酶(2U/μl)1μl

分子病理学常用研究方法第25页3.混合后37℃保温1-2h(可达20h)4.加入2μlpH8.0200mMEDTA终止反应5.加入2μl糖原(10mg/ml)6.加2.5μl4MLiCl或3MNaAc(pH5.5)7.加75μl无水乙醇(-20℃预冷)8.混合后-70℃30'9.13000g4℃离心15'，弃上清10.加100μl70%乙醇(预冷)洗，离心弃上清11.真空干燥，加50μlTE(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)溶解，-20℃保留

分子病理学常用研究方法第26页末端标识法：用于短链DNA或寡核苷酸探针标识敏感性较低40个以上碱基检测较稳定又分3'端标识法和5'端标识法3'端标识法：原理：DIG-11-ddUTP在末端脱氧核苷酸转移酶作用下与寡核苷酸3'端相连分子病理学常用研究方法第27页5'端标识法：原理:在碱性磷酸酶作用下把5‘端磷酸脱去,T4噬菌体多核苷酸激酶将[γ-32P]ATPγ-32P转移到5'端PCR扩增标识法：用于cDNA合成和标识，方法简单DNA用量少，产量多原理：TaqDNA多聚酶以DNA为模板，在引物引导下合成带有标识核苷酸cDNA探针。分子病理学常用研究方法第28页PCR扩增标识法分子病理学常用研究方法第29页1.于Eppendorf离心管中加入10×PCR缓冲液5μl(1×)MgCl22～10μl(1～5mM)引物适量(0.1～1μM)标识/非标识dNTP5μl(200μM，dTTP:Dig-dUTP=3:1)

ddH2O加到50μl模板DNA1～100ngTagDNA多聚酶0.2～1μl(1～5units)分子病理学常用研究方法第30页反应组对照组1对照组2DNA模板++-Dig-dUTP+--2．混合后PCR仪扩增循环温度时间194°C5’94°C45’

2～3155＋0.2°C45’

72°C90’

3272°C5’

334°CHold分子病理学常用研究方法第31页3.纯化和判定乙醇沉淀法：100μlPCR产物加10μl4MLiCl和300μl预冷100%乙醇，-20˚C，2小时，离心4˚C13000g，5分钟Agarose凝胶电泳分子病理学常用研究方法第32页RNA体外合成/标识法：用以合成并同时标识RNA探针产量高，NTP浓度要求低，不用纯化原理：将模板DNA(双链)插入带有噬菌体RNApol开启子特定质粒，在体外RNApol作用下，以DNA为模板、开启子为起点，合成带有标记核苷酸RNA探针。分子病理学常用研究方法第33页杂交组织化学RNA体外合成/标识法pGEM分子病理学常用研究方法第34页1.

于Eppendorf离心管中加入DNA模板(酶切成线性)1μg

含噬菌体开启子质粒NTP标识混合物2μl

含10mMATP，10mMCTP10mMGTP，6.5mMUTP3.5mMDIG-11-UTP10×反应缓冲液2μl

DEPC处理H2O加至17μl分子病理学常用研究方法第35页

2.混合后加：RNase抑制剂1μl

RNA多聚酶(SP6/T7)2μl

3.柔和混合后37℃保温2h

4.加入DNaseⅠ2μl，37℃15'(去除模板DNA)

5.加入2μl200mMpH8.0EDTA

6.加入2.5μl4MLiCl和75μl预冷乙醇

7.混合后置-70℃，30'或-20℃过夜

8.4℃13000g离心15'，弃上清

9.加100μl70%乙醇(预冷)洗，离心弃上清10.真空干燥，加100μlDEPC-H2O溶解，-20℃保留

分子病理学常用研究方法第36页化学修饰法：惯用有光敏生物素、磺化可用以标识单/双链DNA或RNA光敏生物素标识：光敏生物素+核酸────标识探针磺化标识：亚硫酸氢钠和甲基羟胺使胞嘧啶C5磺化，生成Sulphon基团。乙酰氨基芴(AAF)标识：N-acetoxy-AAF与探针一起孵育时，AAF基团与鸟嘌呤核苷残基共价结合分子病理学常用研究方法第37页3.标识探针纯化目标：去除无机盐、dNTP、酶等方法：沉淀离心法

加入EDTA中止反应，再加4MLiCl和乙醇冷冻离心，乙醇洗涤，干燥后用缓冲液溶解

玻璃纤维滤过法

反应物与玻璃纤维结合，清洗，缓冲液洗脱分子病理学常用研究方法第38页4.标识结果检验目标：证实标识结果；预计探针得率；测试检测条件非同位素标识探针检验：采取斑点印迹法不一样浓度(10倍梯度稀释)标识探针点尼龙膜常规检测系统显色未标识探针点膜后用标识探针杂交分子病理学常用研究方法第39页不一样浓度（10倍梯度稀释）标识探针点尼龙膜DNA／RNA探针：0.01pg～1ng／ul寡核苷酸探针：0.08FM～50fM/ul紫外照光或加热120℃30’固膜缓冲液1洗膜（100mM马来酸，150mMNaC1，pH7.5）缓冲液2（1%阻断剂，缓冲液1配）30’抗DIG一碱性磷酸酶1：5000，孵育30’缓冲液1洗膜缓冲液3浸2’(100mMTris-HC1．100mMNaC1，50mMMgC12，pH9.5）显色液（NBT：BCIP，9:7），作用0.5～16h缓冲液3洗膜分子病理学常用研究方法第40页三、组织处理和标本制作

目标：保留好被测核酸维持形态结构

方法：新鲜取材、及时固定适当固定液：4%多聚甲醛(用0.1MPB配制)

用于：冰冻或石蜡切片细胞培养片、细胞涂片或切片分子病理学常用研究方法第41页DNA稳定性好，普通不需特殊处理

RNA酶灭活(杂交前)：组织内Rnase:固定剂灭活玻璃器皿：180℃处理3h以上用DEPC(二乙基焦碳酸盐)水处理试剂：用DEPC水配制和/或高压消毒带手套操作RNase抑制剂分子病理学常用研究方法第42页检测RNA时标本制备及玻片处理常规：

切片处理：切片插架──热水稀释中性洗涤剂浸泡30'──流水冲洗──高压消毒──流水冲洗──蒸馏水洗──180℃3h──APES处理(2%APES/甲醇）室温1'，甲醇洗──DEPC水洗──阴干

标本处理：4%多聚甲醛(PB配)4℃过夜──乙醇脱水──二甲苯透明──石蜡包埋──切片

DEPC水：0.1DEPC，室温放置3h，高压消毒分子病理学常用研究方法第43页四、原位分子杂交

要求：提升敏感性降低非特异着色

方法：去垢剂(TritonX-100)：增强组织通透性

蛋白酶(蛋白酶K)消化：增加通透性、去除杂蛋白

稀酸：杂蛋白变性、去内源性酶、暴露靶核酸

乙酰化处理：中和阳离子，降低静电吸引

适当杂交条件：温度、离子强度、pH探针种类、大小、浓度

杂交液：葡聚糖：增加探针相对浓度鱼精DNA、tRNA应用：封闭

充分洗涤分子病理学常用研究方法第44页1.杂交前处理石蜡切片常规脱蜡，PB洗片，[TritoX-100]蛋白酶K消化，37℃，(1～15μg/ml，15～120')4%多聚甲醛后固定，室温10'PB洗片1～2'×2；0.2MHCl，室温10'；PB洗片1～2'×20.1M三乙醇胺(DEPC-H2O配)，室温2～3'三乙醇胺/无水乙酸室温10'PB洗片，室温2'×270%→80%→90%→100%→100%酒精脱水室温干燥分子病理学常用研究方法第45页2.杂交（预杂交）滴加杂交工作液，蜡膜盖片，湿盒内，50℃16～20h(检测DNA时要求先变性(90~100度)，探针为双链DNA也要变性)

杂交液：甲酰胺50%Tris-HClpH7.610mMDEPC-H2OEDTApH8.01mM加到50.0mlNaCl600mM-70℃保留Denhart's液1×SDS0.25%分子病理学常用研究方法第46页50%×Denhart's液：聚蔗糖(Ficoll400)10g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)10g牛血清白蛋白(BSA)10gDEPC-H2O1000ml杂交工作液：1ml杂交液加tRNA(最终浓度0.3～0.5mg/ml)加标识探针(最终浓度0.5～5μg/ml)每张切片用50μl分子病理学常用研究方法第47页杂交条件优化：

温度：温度高反应快，温度太高破坏组织，普通Tm-25℃G:C多者Tm高(G:C50%Tm约为70℃)甲酰胺可降低杂交温度(1%下降0.35～0.65℃)

探针：长杂交快(太长时穿透性差)复杂性高杂交时间长浓度高杂交时间短离子强度和pH：离子强度高杂交体稳定性好（0.01-0.4M)两价阳离子可使DNA结合牢靠，用EDTA去除惯用50%甲酰胺，pH6.5～7.5，45～65℃，杂交16～20h分子病理学常用研究方法第48页3.杂交后处理

洗片：5×SSC，50℃1'去膜；5×SSC，50℃5'2×SSC+50%甲酰胺，50℃30'TNE(Tris-HClpH7.6+NaCl+EDTA)，37℃10'

RnaseA(1mg/100mlTNE)，37℃30'TNE，37℃10'2×SSC，50℃15'；0.2×SSC，50℃15'×2

严格度：甲酰胺浓度高温度高高严格度离子强度低分子病理学常用研究方法第49页4.显色反应(大致同免疫组化)BufferⅠ(0.1MTris-HClpH7.5含0.15MNaCl)，室温1'1.5%阻断剂(用BufferⅠ加热配制)，室温45'抗DIG-AP，37℃30～60'，4℃过夜BufferⅠ，室温15'×2BufferⅢ浸片(0.1MTris-HCl+0.1MNaCl+50mMMgCl2，pH9.5)，室温5'，显色液(NBT+BCIP+2mlBufferⅢ)，避光室温，30'以上TE(10mMpH7.6Tris-HCl+1mMEDTA)中止反应H2O洗片甘油明胶封片分子病理学常用研究方法第50页5.对照阴性组织片对照阳性组织片对照(包含分布)探针Northernblot检测探针正义链阴性对照不标识探针竞争抑制不含探针阴性对照(显色阶段对照)DNase或RNase消化后阴性对照(非核酸吸附)核酸原位杂交与蛋白产物免疫组化检测对照其它阳性或阴性对照（载体对照）分子病理学常用研究方法第51页四、杂交组化技术进展1.双重及多重杂交组化技术（最好选择不一样检测系统）2.与免疫组化结合应用双重检测(普通先作免疫组化)同时检测核酸和蛋白产物3.电镜下杂交组化方法与免疫电镜相同多采取PG或PLP固定、包埋后法、胶体金标识细胞则多用包埋前法分子病理学常用研究方法第52页4.原位PCR技术将PCR与杂交技术结合起来，以提升敏感性间接原位PCR：先扩增后杂交方便、敏感、特异性差直接原位PCR：加入引物、标识核苷酸、DNA聚合酶等，直接以靶链为模板合成DNA并检测出相正确DNA杂合体5.原位反转录PCR（也分直接和间接法）在PCR扩增前先进行反转录，rTth酶出现使其更为轻易分子病理学常用研究方法第53页五、杂交组化应用1.病原体检测病毒：HPV(16，18)──宫颈癌

EBV──鼻咽癌

HBV──肝癌、肝炎──肾炎(IgA肾病)

CMV──AIDS病等原位PCR显示肝炎肝细胞内HCV阳性分子病理学常用研究方法第54页

2.肿瘤基因检测癌基因染色体定位癌基因mRNA检测──癌基因活化宫颈癌癌细胞内p53表示分子病理学常用研究方法第55页3.mRNA检测(敏感性较Northernblot低，可准确到细胞水平)原位杂交显示肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞TIMP-2阳性分子病理学常用研究方法第56页荧光原位杂交---FluorescenceInSituHybridization原理采取荧光标识DNA探针，利用探针与被检测样本DNA碱基正确互补性，在探针与样本DNA杂交后，经过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果，从而检测细胞，组织样本中染色体异常。分子病理学常用研究方法第57页FISH：“钓鱼”技术分子病理学常用研究方法第58页分子病理学常用研究方法第59页细胞周期不一样阶段分子病理学常用研究方法第60页分子病理学常用研究方法第61页探针是一段荧光标识核酸（DNA）片段，被用作寻找另一互补DNA(靶标）指示。DNA靶标可能是一个特异性条带、一个基因、一个染色体片段或一个完整染色体探针（probe)及靶标（target)分子病理学常用研究方法第62页适合用于间期FISH标本石蜡切片分离细胞核肿瘤组织印片细胞离心涂片血液或骨髓涂片细胞爬片或切片分子病理学常用研究方法第63页FISH探针类型全染色体涂抹探针（WCP）染色体计数（着丝粒）探针（CEP）位点特异性探针（LSI）双色分离重排探针双色双融合易位探针xyxx分子病理学常用研究方法第64页可检测样本包含分子病理学常用研究方法第65页分子病理学常用研究方法第66页临床应用领域分子病理学常用研究方法第67页分子病理学常用研究方法第68页TERC基因分子病理学常用研究方法第69页分子病理学常用研究方法第70页

HPV→hTERC=宫颈癌？分子病理学常用研究方法第71页分子病理学常用研究方法第72页子宫颈癌研究最新进展中国医学论坛报/年/12月/4日/第B03版IGCS会议报道hTERC扩增诊疗宫颈癌及癌前病变

当前宫颈癌筛查主要经过宫颈细胞学检验及人乳头状瘤病毒（HPV）检测，但这些方法临床应用都有一定不足。今年研究致力于寻找新指标来帮助诊疗宫颈癌前病变，尤其是判别出高度病变，以提升筛查准确性和可预测性。人端粒酶RNA（hTERC）是人端粒酶组分之一，有研究证实，端粒酶激活是HPV整合入宫颈细胞后，上皮内瘤样病变（CIN）向宫颈癌转化关键步骤。此次大会口头汇报中北京大学人民医院魏丽惠等提交一项研究颇为引人注目，该研究发觉，经过荧光原位杂交（FISH）检测宫颈细胞学涂片中hTERC基因扩增情况，在宫颈癌和癌前病变诊疗中含有主要价值。分子病理学常用研究方法第73页TERC与子宫颈癌级别国内1000多例临床试验结果分子病理学常用研究方法第74页TERC在临床中意义分子病理学常用研究方法第75页TERC在临床中意义-风险预测针对HPV高危宫颈癌易感人群,在常规TCT筛查基础上,加做TERC基因检测,可帮助医生判断病人疾病风险分子病理学常用研究方法第76页

改进子宫颈癌筛查与诊疗伎俩分子病理学常用研究方法第77页TERC在临床中意义-CIN1患者分流治疗分子病理学常用研究方法第78页TERC在临床中意义-CIN1患者分流治疗分子病理学常用研究方法第79页TERC在临床中意义-CIN2患者分流治疗分子病理学常用研究方法第80页TERC在临床中意义-术后评定，复发监测

TERC（-）：手术病灶切除洁净，并无复发，定时随访观察TERC（+）：高度怀疑有病灶没有被完全切除，或者有复发。依据病人情况再次进行手术治疗分子病理学常用研究方法第81页TERC在临床中意义-判别诊疗对于30岁以前HPV阳性病人，大多是一过性感染，可用TERC探针进行判别诊疗。

TERC（-）：一过性感染TERC（+）：有癌变风险，采取治疗办法对于怀孕期妇女，雌激素可使移行带区基底细胞出现不经典增生甚至类似原位癌改变，与宫颈原位癌判别困难。但前者在产后能恢复正常。TERC（-）：雌激素引发，无需治疗，产后自然恢复正常TERC（+）：高度怀疑原位癌，亲密随诊，产后六周进行对应治疗分子病理学常用研究方法第82页TERC在临床中意义-判别诊疗CIN1和CIN2病理学上有时难以区分，不过对指导临床治疗有主要意义TERC（-）：90%可能为CIN1，按CIN1方案治疗TERC（+）：90%可能为CIN2，按CIN2方案治疗分子病理学常用研究方法第83页TERC指导临床治疗小结分子病理学常用研究方法第84页临床惯用检测项目-宫颈癌分子病理学常用研究方法第85页三种检测方法比较方法特异性（％）敏感性（％）形态学检测9055-80HPV检测64－9584-100FISH9090分子病理学常用研究方法第86页TERC基因阳性图原位癌术后复查分子病理学常用研究方法第87页TERC基因阴性图分子病理学常用研究方法第88页TERC基因FISH检测检测样本：TCT采集、生理盐水采集、活检标本石蜡切片、手术标本石蜡切片分子病理学常用研究方法第89页分子病理学常用研究方法第90页FISH检测TERC基因结果判读：标本为新鲜宫颈细胞制片：阈值建立采集20例正常人宫颈细胞。阈值测定：每例分析最少100个细胞，统计出现2个以上TERC信号细胞数目标百分比。阈值=平均数（M）+3X标准差（SD）结果判断每例样本随机计数细胞（最少100个），假如检测值大于阈值，判定为阳性结果；假如检测值小于阈值，判定为阴性结果；假如检测值等于阈值，加大观察样本细胞数目。标本为组织石蜡切片：连续3个细胞出现2个以上TERC信号，即判为阳性。分子病理学常用研究方法第91页FISH检测Her-2基因扩增分子病理学常用研究方法第92页分子病理学常用研究方法第93页分子病理学常用研究方法第94页分子病理学常用研究方法第95页分子病理学常用研究方法第96页分子病理学常用研究方法第97页Her-2基因扩增模式分子病理学常用研究方法第98页Her-2基因扩增模式分子病理学常用研究方法第99页分子病理学常用研究方法第100页赫赛汀在胃癌中应用分子病理学常用研究方法第101页分子病理学常用研究方法第102页随访终点指标分子病理学常用研究方法第103页赫赛汀在胃癌中应用—小结分子病理学常用研究方法第104页分子病理学常用研究方法第105页TOP2A基因分子病理学常用研究方法第106页测TOP2A基因意义分子病理学常用研究方法第107页分子病理学常用研究方法第108页计数100个细胞，统计Ratio值（红信号数/绿信号数）FISH阳性：1.EGFR基因扩增（1）Ratio≥2为阳性结果，提醒该样本有EGFR基因扩增（2）大于等于15个红色信号细胞数占细胞总数10%以上，为阳性结果，提醒该样本有EGFR基因扩增（3）出现成团扩增细胞，为阳性结果，提醒该样本有EGFR基因扩增2.高多体性

Ratio＜2，但大于等于4个红色信号细胞占细胞总数40%以上，为阳性结果，提醒该样本为EGFR基因高多体性扩增FISH阴性除以上阳性情况上，其余结果均为阴性结果分子病理学常用研究方法第109页淋巴瘤诊疗和治疗——对病理医生和临床医生挑战淋巴瘤分类复杂（年WHO分类）不一样类型淋巴瘤有着不一样预后，需要不一样治疗；即使是相同类型肿瘤，因为携带不一样分子遗传学异常，对治疗反应也可能不一样;多数淋巴瘤综合临床特征、组织形态学、免疫表型特征可得到正确诊疗;分子遗传学检测能够提供更多普通病理学检验所不能提供信息。分子病理学常用研究方法第110页诊疗BCDA临床特征形态学免疫表型分子遗传学淋巴瘤诊疗—临床特征、形态学、免疫表型及分子遗传学相结合分子病理学常用研究方法第111页淋巴瘤常见染色体易位及所累及基因分子病理学常用研究方法第112页FISH检测淋巴瘤分子遗传学异常惯用探针双色分离重排探针（DualColorBreakApartRearrangementProbe）双色双融合易位探针（DualColor，DualFusionTranslocationProbe）染色体计数探针（Chromosomeenumerationprobe,CEP）分子病理学常用研究方法第113页①切片准备：选择杂交区域，脱蜡水化、酶消化、脱水干燥②变性、杂交③洗涤、封片④观察：荧光显微镜。间期FISH方法分子病理学常用研究方法第114页间期FISH结果观察与解读分子病理学常用研究方法第115页双色分离重排探针（BCL2）正常分离基因拷贝数增加分子病理学常用研究方法第116页间期FISH结果观察与解读分子病理学常用研究方法第117页正常融合基因拷贝数增加双色融合易位探针(IGH/BCL2）分子病理学常用研究方法第118页间期FISH结果观察与解读分子病理学常用研究方法第119页正常染色体数目增加染色体着丝粒探针（2号染色体，橙色）分子病理学常用研究方法第120页有利于诊疗、分类经过特异性遗传学异常来确定淋巴瘤类型判定预后、指导治疗

FISH检测淋巴瘤分子遗传学异常意义分子病理学常用研究方法第121页间期FISH在淋巴瘤中应用举例侵袭性成熟B细胞淋巴瘤小细胞性B细胞淋巴瘤

外周T细胞淋巴瘤

B淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病分子病理学常用研究方法第122页Burkitt淋巴瘤(BL)t(8q24)/IG-cMYC含有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤之间特征不能分类B细胞淋巴瘤(IntermediateBL/DLBCL)（Double-hit）t(8q24)/nonIG-cMYC（35-50%）t(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2

（15%）t(3q27)/BCL6-IGH

（少）弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)（Double-hit）

t(8q24)/IG(nonIG)-cMYC（10%）

t(3q27)/BCL6（30%）t(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2

（20-30%）t(3;14)(p14;q32)/FOXP1-IGH（3%）侵袭性成熟B细胞淋巴瘤分子病理学常用研究方法第123页利用FISH检测以上三个类型淋巴瘤分子遗传学异常，通常使用以下探针：双色分离重排探针：IGH、C-MYC、BCL2、BCL6双色双融合易位探针：IGH/C-MYC

侵袭性成熟B细胞淋巴瘤分子病理学常用研究方法第12