(高清版)GBT 41917-2022 纳米技术 电子自旋共振（ESR）法检测金属氧化物纳米材料产生的活性氧（ROS）

国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I Ⅲ 12规范性引用文件 1 1 13.2缩略语 14原理 24.1概述 2 24.2.1概述 2 2 2 2 3 3 3 3 3 4 47.1测试样品制备(金属氧化物纳米材料悬浮液) 47.2产生羟基自由基的溶液制备 47.2.1FeSO₄溶液 4 4 47.3.1磷酸缓冲液 47.3.2次黄嘌呤溶液 47.3.3黄嘌呤氧化酶溶液 5 57.5自旋捕获剂的制备 5 5 5Ⅱ7.5.3BMPO储备液 5 5 7.6.1概述 5 67.6.3BMPO的反应 67.6.4TPC的反应 67.7阳性对照和自旋捕获剂的反应 6 7.7.2BMPO自由基加合物的形成(BMPO/·00H) 6 7.8用于自旋计算的标准物质的制备 6 7 78.2采样时间 7 7 9.2样品注入 8 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件等同采用ISO/TS18827:2017《纳米技术电子自旋共振(ESR)法检测金属氧化物纳米材料产生的活性氧(ROS)》。文件类型由ISO的技术规范调整为我国的国家标准。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识材料的细胞毒性和遗传毒性的科学原理尚不完全清楚。活性氧(ROS)的产生是纳米毒性的一个重要机制。金属氧化物纳米材料的危害效应研究尚处于起步阶段。ROS的产生能力是金属氧化物纳米材pH4。因此，为了检测并定量金属氧化物纳米材料表面产生的ROS,本文件提出了电子自旋共振然而，在室温下直接检测溶液中的某些自由基(如超氧阴离子和羟基自由基)是非常困难或不可能的[5]。ESR自旋捕获技术是研究瞬态自由基的一种非常有用的工具[6]。发展于20世纪60年代末的基(自旋加合物),再使用ESR波谱仪检及2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-3-氨甲酰胺(TPC)和单线态氧的加合物的方法。本文件提供了一种在非细胞环境下评估金属氧化物纳米材料产生ROS的方法。该方法可为处在理化性质评估阶段还未进行1纳米技术电子自旋共振(ESR)本文件描述了一种利用电子自旋共振(ESR)检测金属氧化物纳米材料在水溶液中产生的活性氧本文件不适用于未使用ROS特异性自旋捕获剂的ESR检测方法。试验样品testsample经充分表征的材料和/或物质。该材料和/或物质当用于某一规定试验方24原理成的加合物对该自由基具有特异的ESR波谱特征。ESR波谱法采用自旋捕获剂可识别不同类型信号由强度比为1:2:2:1的四重峰组3GB/T41917—2022/ISO/TS18827示出强度比为1:1:1的三重峰[14],超精细分裂常数an=0.172mT[15]。超氧阴离子和单线态氧。这些体系证实了自旋捕获剂的适用性，自旋加合物可重复产生E双氧水氧化为三价铁离子，生成一个羟基自由基和一个氢氧根离子(反应1)。芬顿反应中产生的羟基·OH+DMPO→DMPO/·OH……(反应2)次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(HX-XO)体系能够产生超氧阴离子(反应3和反应4)。超氧阴离子可被BMPO捕获形成自旋加合物BMPO/·0OH(反 (反应3) (反应4)O₂-+BMPO→BMPO/·0OH……(反应5)孟加拉红是单线态氧的光敏剂。当光激发时，孟加拉红将其激发态能量转移至氧分子产生单线态氧(反应6和反应7)。单线态氧可被TPC捕获形成加合物TPC/¹O₂(反应8)。……(反应6)孟加拉红·+O₂→孟加拉红+O₂……(反应7)¹O₂+TPC→TPC/¹O₂……(反应8)5试剂5.3去离子水(25℃时18.2MΩ)。47.2.1FeSO₄溶液7.2.2H₂O₂溶液5使用的DMPO纯度应≥99%,在一20℃避光防潮储存。将DMPO溶解在去离子水中制成使用的BMPO纯度应≥99%,在一20℃避光防潮储存。将BMPO溶解在去离子水中制成次黄嘌呤6终浓度78.1采样若纳米材料导电，会导致微波功率损失。为防止这一损失，第一种选择是在极低温度下(4K)测纳米材料与自旋捕获剂反应后，用过滤或离心的方法将其去除。应根据纳米不相同。因此制样后要立即进行多次测试。取样后进行ESR测试的最佳时间应通过实验确定。9.1概述举了ESR测量的参数设置。ESR波谱仪的操作步骤宜参照所使用光谱仪的操作说明。图1给出了测量流程图。中心场士5mT~±10mT强度扫描时间时间常数8步骤9.3.1步骤9.3.1插入Mn²标记物步骤9.3.2插入样品池步骤9.3.3参数设置中心场，扫描步长，扫描时间开始测试步骤9.3.6验证信号步骤9.3.7记录仪的基线调整步骤9.3.8ROS的定量步骤9.3.9在记录仪上记录信号步骤9.3.10关闭仪器步骤9.3.11水溶液(1%～30%的盐酸或硝酸)和去离子水彻底冲洗。9.3ESR测试9.3.2插入Mn²+标记物将Mn²+标记物置于腔体中。9GB/T41917—2022/ISO/TS189.3.3插入样品池将样品池竖直插入到共振腔中。每次测量时样品池应在同一个位置。腔的种类对灵敏度有很大的影响。用“品质因子”(Q因子)来表征腔的性能。Q因子表示腔储存微波能量的效率。波谱仪的灵敏度随Q因子的增大而增大。液态水会强烈吸收用于ESR测试的微波的能量。如果测试的是水溶液，应用平底的石英样品池装样品，使样品池薄的部分平行于腔的电场方向(通常情况下是平行于腔的磁场方向)。确保样品放在了腔中合适的位置，即在腔的中央。9.3.4调整与微波单元相关的条件设置微波功率设置频率频率表示微波的振荡频率。调节共振峰的峰谷至中心位置，即从图2(X)至图2(O)。图2调整频率调整μ相位如果出现图3所示的共振凹陷，调整μ相位使得凹陷形状呈现出图2(O)。图3共振凹陷变形图4调整耦合程度(无单位)见表2。放大器的增益，数值在1～10000之间变化。在优化条件下可获得最好的信噪比(S/N)。增益过低会使信噪比变差，增益过高则会使波谱的上信号通常为吸收光谱的一阶导数。如果波谱信噪比很高且有些区域需要更好的分辨率，可用二阶测试需要的微波输出强度根据测试样品的不同而有所变化，需要对能量进行必要的调整。通过微波输出功率改变对ESR信号的影响可以确定优化的输出功率。虽然信号强度与微波输出功率的平方根成比例，但是有一些样品会出现微波强度增大后，ESR信号出现饱和以及波形变形。对于这些会饱和的样品以及未知的样品(不知是否会出现饱和),通常采用将微波输出分几步从最小值到最大值逐步见图5。GB/T41917—2022/ISO图5DMPO自由基加合物(DMPO/·OH)的形成见图6。HH见图7。见图8。注1:信号强度为1:1:1的三重峰。注2:在去离子水中，an=16.8G。9.3.9ROS的定量由式(1)定量ROSX=(B/A)×(D/C)×(3.0×10⁴sp) (1)A——标准物质的吸收峰面积(1.0×10-³mmol/LTEMPOL);B——测试样品的吸收峰面积；C——含标准物质的Mn²+标记物的吸收峰面积；D——含测试样品的Mn²+标记物的吸收峰面积；测试样品(纳米材料)的自由基浓度取决于与标准物质(TEMPOL)和测试样品的吸收峰面积之比。1.0×10-³mmol/LTEMPOL的自由基数目为3.0×10¹⁴sp。标准物质和测试样品应在相同的仪器参9.3.11关闭仪器选择“EXIT”。10测试结果举例见图9。GB/T41917—2022/ISO/TS见图10。图10BMPO自由基加合物(BMPO/·00H)的ESR谱图见图11。见图12。ewMewM图12TEMPOL标准的ESR谱图[1]GB/T16886.5—2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验[4]FUP.P.,XIAQ.,HWANGH.M.,RAYP.C.,YUH.Mecerationofreactiveoxygenspecies.J.FoodDrugAnal.2014,22(1)pp.64-75[5]ISAKSENI.S.A.,&DALSORENS.Bradical.Science.2011,331(6013)pp.[6]HIROTAK.,SUGIMOTOM.,KATOM.,TSUKAGOSHIMOTOH.Preparationofzincoditions.Ceram.Int.2010,36[7]ZAVOISKYE.Spin-magneticresonanceinparamagnetics.J.Phys.USSR.1945,9pp.245 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