GB/T 43162-2023 欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法（正式版）

ICSCCS65.020.20国家标准化管理委员会国家市场监督管理总局发布国家标准化管理委员会 I 2规范性引用文件 5方法原理 6器材和试剂 28实验室鉴定 2 410样品保存 411结果记录和资料保存 4附录A(资料性)欧洲樱桃绕实蝇其他信息 5附录B(资料性)欧洲樱桃绕实蝇为害状 附录C(资料性)欧洲樱桃绕实蝇形态特征图 附录D(资料性)欧洲樱桃绕实蝇与近似种分类检索表 附录E(资料性)欧洲樱桃绕实蝇基因组DNA提取方法 附录F(资料性)欧洲樱桃绕实蝇常规PCR检测 附录G(资料性)欧洲樱桃绕实蝇实时荧光PCR检测 IGB/T43162—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国满洲里海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国阿拉山和国二连海关、中华人民共和国呼和浩特海关。1GB/T43162—2023欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法本文件描述了欧洲樱桃绕实蝇Rhagoletiscerasi(Linnaeus,1758)的检疫鉴定方法。本文件适用于植物及植物产品中欧洲樱桃绕实蝇的检疫和鉴定。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文SN/T1383—2004苹果实蝇检疫鉴定方法SN/T1847—2006寡毛实蝇类害虫分类学术语SN/T1383—2004和SN/T1847—20064欧洲樱桃绕实蝇基本信息ripes(Rohdendorf,1961),Rhagoletisobsoleta(Hering,1936),Tephritisceraci(Persson,1958),Trypetasignata(Meigen,1826),Urophoracerasorum(Dufour,1845),Urophoraliturata分类地位：双翅目(Diptera),实蝇科(Tephritidae),绕实蝇属(Rhagoletis)欧洲樱桃绕实蝇的其他信息见附录A。蝇特异性扩增引物的常规PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法，进行种类鉴定。2GB/T43162—20236器材和试剂液A[1%十二烷基硫酸钠(SDS),50mmol/LTris·HCl(pH8.0),25mmol/L氯化钠，25mmol/L乙或者怀疑带虫的果实进行饲养观察，饲养方式见附录A中A.5。欧洲樱桃绕实蝇为害状见附录B。8实验室鉴定8.1.1绕实蝇属(Rhagoletis)形态特征绕实蝇属(Rhagoletis)主要形态特征如下。——成虫颊高通常不及复眼高的1/4,具下额眶鬃3对～4对，上额眶鬃2对，单眼鬃发达，其长短——触角第3节末端常呈角状突起(部分种类端圆)。-—中胸背板常具4条棉毛纵带并与黑色到暗褐色的背板相映；背中鬃的位置较前，约在前翅上鬃连线上或其稍后处。中胸背板具缝前背侧鬃，小盾鬃2对。-—翅cup室宽，其宽明显超过bm室的一半，且通常与bm室宽近等。径中(R-M)横脉位于接近dm翅室的中点处。cup室后端角延长段短，其长不超过A₁+CuA₂脉长的1/5。CuA₂脉段——腹部第2节～第4节腹背板(雄成虫)或第2节～第5节腹背板(雌成虫)大多具淡黄色到白色的基横带。成虫(见附录C)的主要鉴定特征如下：——成虫以黑色或黑褐色为主(见图C.1);——雌虫体长5.0mm～6.2mm,雄虫体长4.0mm～4.5mm;3GB/T43162—2023—上侧额鬃2对，下侧额鬃3对，单眼鬃发达，与下侧额鬃近等长(见图C.2); 后小盾片黑褐色，中背片全黑褐色——各足腿节具暗褐色；缘横带(见图C.4);节腹板后缘深凹(见图C.6);3个骨化的受精囊。卵(见附录C)的主要鉴定特征如下：——卵粒大约长0.75mm,宽0.25m幼虫(见附录C)的主要鉴定特征如下：-——胸部前气门扇形(见图C.10),前缘指突12个～15个，单排(见图C.11);后气门位于中线上方(见图C.12),气门裂长是宽的4倍～5倍，有骨化缘(见图C.13);蛹(见附录C)的主要鉴定特征如下：绕实蝇属已知共约68种，本文件描述了其中最具经济意义的种类17种。欧洲樱桃绕实蝇与近似种的分类检索表见附录D。4GB/T43162—20238.2分子生物学鉴定8.2.1实蝇基因组DNA提取欧洲樱桃绕实蝇基因组DNA提取制备方法见附录E。8.2.2常规PCR检测常规PCR检测具体步骤见附录F。8.2.3实时荧光PCR检测实时荧光PCR检测具体步骤见附录G,阳性对照、阴性对照和空白对照的设置同F.4。9结果判定9.1形态学方法以成虫的形态特征为依据，符合形态特征的个体可鉴定为欧洲樱桃绕实蝇。卵、幼虫、蛹的形态特征可作为鉴定的参考依据。9.2分子生物学方法如果阳性对照和待测样品的电泳成像结果均出现约222bp的预期扩增片段，而阴性对照和空白对照均未出现预期扩增片段，则可判定样品为欧洲樱桃绕实蝇。9.2.2实时荧光PCR检测在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，即阳性对照Ct值<35并出现典型扩增曲——检测样品的Ct值≤35时，判定为欧洲樱桃绕实蝇；——检测样品无扩增曲线或Ct值>40时，判定为非欧洲樱桃绕实蝇；——检测样品的35<Ct值≤40时，应重新进行测试。10样品保存用于形态学鉴定所采集的标本若有多头，则一部分保存在内盛75%乙醇的广口瓶中，另一部分制用100%乙醇浸泡，保存于一70℃超低温冰箱中备用。11结果记录和资料保存人和试验人员的签字。PCR检测需有电泳结果照片，实时荧光PCR检测需有检测结果照片。相关资料保存6个月以上。5GB/T43162—2023(资料性)A.1地理分布A.2寄主植物蔷薇科Rosaceae:酸樱桃Prunuscerasus,欧洲甜樱桃Prunusavium,黑樱桃Prunusserotina,马哈利酸樱桃Prunusmahaleb。ceratataricaL.var.Micrantha。A.3生物学习性1年1代，以专性滞育蛹在紧邻寄主的土壤中越冬。越冬蛹进入滞育需要一个寒冷时期。仅5%~15%的蛹可以在笠年春天羽化为成虫，其余的蛹可继续在土壤中滞育1年～2年，少数蛹可在土壤中滞育多年。蛹在高黏性土壤滞育率高于砂性土壤。这些遗留在土壤中的蛹表现高度的适生性，以避免其种群在寄主植物不结果的年份遭到灭绝。在羽化为成虫的前几天，蛹从黄色变成绿色。成虫的出现和生命周期与寄主植物的物候习性关系密切。成虫的羽化受到春季土壤温度、冬季滞育的温度条件和寄主植物地理位置的影响。在欧洲和亚洲，羽化的成虫通常发生在5月中旬至6月中旬。产卵前，成虫需通过6d～13d的时间发育成熟，其主要食物为鸟粪和植物蜜露等。欧洲樱桃绕实蝇整个成虫期可长达7周～11周。产卵发生在温度升高到16℃以上的温暖天气。持续的晴好天气能够引起产卵极度爆发。成虫通可以阻止在同一粒水果上的进一步的产卵行为。但在寄主果实匮乏时会发生同一粒果实上的双卵情况。每头雌虫最多可产卵469粒卵(平均200粒/头),每天产卵可多达59粒(平均26粒/头)。卵的孵化率在54%～100%之间。幼虫共3个龄期，3龄幼虫大小为4.5mm～6mm。幼虫发育至老熟幼虫的时间受温度和寄主果A.4为害情况雌成虫在被害果实上留下微小的产卵孔，卵在果实内发育成幼虫，幼虫以果肉为食。幼虫破坏果果实腐烂。6GB/T43162—2023A.5饲养方式A.5.1卵或幼虫的饲养将现场采取的卵或幼虫部分个体制成鉴定标本，其余个体继续用原寄主果实培养。具体的培养方法为：将带有卵或幼虫的寄主果实放在小号白瓷盘里，然后将小号白瓷盘放在装有自来水的大号白瓷盘内，再用防虫网罩住小号白瓷盘，罩的下方边缘浸没于大号白瓷盆内的水中。置于温度为20℃~25℃、相对湿度为30%～60%的生物培养箱中饲养至幼虫老熟。A.5.2蛹的饲养取一盛有洁净细砂的养虫杯(沙子厚度10cm,含水量5%～10%),将现场检疫收集的或室内培养得到的围蛹埋于距细砂表面3cm～5cm处(若是老熟幼虫则可直接将其置于细砂表面，幼虫将钻入沙中化蛹)。将养虫杯放置于5℃以下的冰箱中冷藏180d左右，取出养虫杯置于温度为22℃~25℃、相对湿度为30%～60%的生物培养箱中饲养，直至成虫羽化。A.5.3成虫的饲养成虫羽化后，悬挂相应寄主果实切片于养虫箱内供其取食；或将白砂糖和啤酒酵母按照1:2(质量比)混合制成饲料放入小容器中喂养，此外，在培养皿中放入几张滤纸，加适量的水浸透滤纸供成虫饮用。待成虫斑纹的色泽和大小稳定(3d～5d)后，收集成虫并置于冰箱冷冻层(约-20℃)0.5h~GB/T43162—2023(资料性)欧洲樱桃绕实蝇成虫产卵为害状见图B.1,幼虫为害状见图B.2。(引自/browse/subthumb.cfm?sub=12166)b)图B.2幼虫为害状8(资料性)欧洲樱桃绕实蝇形态特征图欧洲樱桃绕实蝇成虫背面观见图C.1,成虫头部和胸部侧面观见图C.2,成虫中胸背板和小盾片见图C.3,成虫翅见图C.4,雌虫腹部背板图C.5,雄虫腹部背板见图C.6。图C.1成虫背面观(仿White和Elsonharris,1992)图C.2成虫头部和胸部侧面观6群甲蚩瓷興蚩晋蛊兽中片里[/唑骅鼎刚中甲华E圆GB/T43162—2023欧洲樱桃绕实蝇卵的形态特征见图C.7。(引自Daniel等，2012)欧洲樱桃绕实蝇3龄幼虫见图C.8,幼虫口钩见图C.9,幼虫前气门见图C.10,幼虫前气门指突见图C.11,幼虫后气门见图C.12,幼虫后气门气门裂图C.13,幼虫肛叶见图C.14。图C.83龄幼虫GB/T43162—2023图C.9幼虫口钩图C.10幼虫前气门图C.11幼虫前气门指突图C.13幼虫后气门气门裂蛹的形态特征见图C.15。GB/T43162—2023GB/T43162—2023(资料性)欧洲樱桃绕实蝇与近似种分类检索表1中胸背板和腹部黄色到橙色，盾片不具灰色纵条…………………2中胸背板和腹部黑色，盾片有2条～4条灰色纵条。小盾片两侧具黑色斑纹，有时基带宽…42翅无明显的亚基横带，但有时亚基区(尤其是c室的基部)色带略暗，端前横带和前端横带通常分离 三带胡桃绕实蝇R.juglandis和M脉处无任何分离斑 3 美翅绕实蝇R.suavis中横带和端前横带常分离，但有时与dm室或CuA₁脉后方狭窄相连；中胸背板全为暗褐色或具有一对垂直的暗褐色中纵条 核桃绕实蝇R.completa 5小盾片基部黑色，黑色部分至少占1/5,但基部和侧面的黑斑有时分离 65翅具后端横带和前端横带，中横带和端前横带沿M脉和CuA₁脉相连，在dm室端1/4形成一透明斑，翅无副前缘横带 黑樱桃绕实蝇R.fausta 欧洲樱桃绕实蝇R.cerasi 7翅无副前缘横带 7中胸背板上的4条纵条前方联合伸到背板前缘。翅无后端横带，但在端前横带和前端横带之间的M脉段上有烟褐色分离斑，前端横带常缩小成分离斑横过R₄+5脉的端部。小盾片有黑色基带和侧黑色斑 茄瓜绕实蝇R.nova中胸背板至少有2条纵条明显分离 88中胸背板两侧纵条各自在端部相连。翅具副前缘横带，前端横带和端前横带在r1室端部相 番茄绕实蝇R.tomatis中胸背板4条纵条两两分离 99翅具后端横带，此带不与其他任何横带相连。中胸背板上的侧纵条仅前端伸到横缝，或略伸到横缝之前 端纹番茄绕实蝇R.lycopersella翅无后端横带。中胸背板上的侧纵条前端伸过横缝 茄绕实蝇R.conversa 翅前端横带与前缘脉间无透明区；该横带至少横过R₄+5脉的端部，或有分离斑覆盖及R₄+5脉 11端前横带从靠近R-M横脉处倾 12产卵管通常长；以苹果类为寄主的个体其产卵管长1.0mm～1.4mm;以山楂类为寄主的个体其产卵管长1.0mm～1.4mm,但佛罗里达的种群，其个体的产卵管长度却只有0.7mm~1.0mm。幼虫为害蔷薇科如苹果属和山楂属等植物果实 苹绕实蝇R.pomonella产卵管通常较短，长为0.7mm～1.1mm。幼虫为害的寄主植物不同上述 13幼虫为害杜鹃科Ericaceae植物，特别是越橘属Vaccinium植物(包括伞房花越橘V.corombo-GB/T43162—2023sum,窄叶乌饭树V.angustifolium,越橘V.vitisidaea)和Gaylussacia属植物(黑果Gaylus-saciabaccata,悬果G.frondosa,短黑果G.dumosa);翅长 越橘绕实蝇R.mendax幼虫为害的寄主植物不同上述 14幼虫为害忍冬科Caprifoliaceae的毛核木属Symphoricarpos植物 幼虫为害山茱萸科Cornaceae的楝木属Cornus植物的一些种类(包括红串果C.canadensis,偃伏楝木C.amomum,熊果楝木C.stolonifera) 15基横带和中横带在A₁+CuA₂脉上方连结………………山茱萸实蝇基横带和中横带不相连……………………醋栗绕实蝇R.ribicola16翅具后端横带……………酸浆绕实蝇R.striatella…………………东部樱桃绕实蝇种团R.cingulatagroupsGB/T43162—2023(资料性)欧洲樱桃绕实蝇基因组DNA提取方法E.1实蝇基因组DNA提取后取出，用灭菌牙签或微量组织捣碎仪捣碎，匀浆，加入等体积3mmol/L醋酸钾(pH7.2),冰上放置1h,加入等体积苯酚和三氯甲烷，混匀，12000g离心10min,取上清液，加入2倍体积冰冻100%乙醇混匀，放置冰箱1h沉淀DNA,12000g离心15min,弃上清液，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀，12000g离心1min,晒干乙醇后用100μL双蒸水溶解沉淀，用核酸蛋白检测仪测定DNA浓度和纯度后，将提取的基因组DNA于-20℃保存备用；也可采用试剂盒方法提取基因组DNA。E.2DNA质量检查用核酸蛋白检测仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸光值，计算核酸的纯度和浓度，按照公式(E.1)计算DNA纯度，按照公式(E.2)计算DNA浓度：……(E.1)p=50×OD₂60……(E.2)式中：Conc.DNA纯度；p——DNA质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);OD₂80——蛋白质在280nm的吸光值。PCR级DNA溶液的OD₂60与OD₂8o的比值应为1.7～1.9。GB/T43162—2023(资料性)F.1引物序列欧洲樱桃绕实蝇常规PCR扩增引物序列见表F.1。表F.1引物序列引物名称引物序列PCR产物大小/bp上游引物：5'-GTAATTGTTACAGCCCATGCC-3下游引物：5'-GTAAACAGTTCAACCTGTC-3′F.2常规PCR反应体系常规PCR反应体系见表F.2,表中反应体系各试剂的量根据具体情况或不同的反应总体积进行适表F.2常规PCR反应体系组成加样量/μL10×PCR缓冲液50mmol/L氯化镁10pmol/L引物OYR5U/μLTaqDNA聚合酶10ng/μL～100ng/μL模板DNAddH₂O补至25F.3常规PCR反应条件预变性95℃3min;变性95℃15s,退火65℃1min,延伸72℃30s,30个循环；72℃10min(当使用不同PCR仪和试剂时，可视情况对反应参数进行适当调整)。F.4阳性对照、阴性对照和空白对照的设置阳性对照：欧洲樱桃绕实蝇的DNA或含有待测基因序列的质粒为PCR模板。阴性对照：不含欧洲樱桃绕实蝇的实蝇DNA为PCR模板。空白对照：双蒸水。各做2个重复。F.5琼脂糖凝胶电泳检测制备1.5%的琼脂糖凝胶，电泳结束后，在凝胶成像分析仪的紫外投射光下观察、拍照。GB/T43162—2023(资料性)欧洲樱桃绕实蝇实时荧光PCR检测G.1引物及探针序列欧洲樱桃绕实蝇实时荧光PCR引物及探针序列见表G.1。表G.1引物及探针序列引物/探针名称引物/探针序列OYF上游引物：5'-GTAATTGTTACAGCCCATGCC-3'OYR下游引物：5'-GTAAACAGTTCAACCTGTC-3'OYP探针：5'-FAM-AGGAGCACCAGATATAGCTTTTCCTCG-BHQ1-3'G.2实时荧光PCR反应体系欧洲樱桃绕实蝇实时荧光PCR反应体系见表G.2。使用具有ROX校正通道的实时荧光PCR仪时，需按仪器要求添加ROX荧光试剂。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。表G.2实时荧光PCR反应体系组成加样量/μL2×TaqManreal-timePCRmastermix10ng/μL～100ng/μL模板DNAddH₂O补至25G.3实时荧光PCR反应条件预变性95℃30s;变性95℃5s,65℃退火35s,40个循环。G.4产物检测每个循环结束后收集荧光信号，根据收集的Ct值和扩增曲线判定结果。GB/T43162—2023[1]刘玮琦，秦誉嘉，陈超，等.利用诱捕技术对欧洲樱桃实蝇进行监测和防控的研究进展69-72.[3]秦誉嘉，卢国彩，刘玮琦，等.樱桃绕实蝇对我国甜樱桃产业的潜在经济损失评估[J].植物[4]秦誉嘉，蓝帅，卢国彩，等.气候变化条件下樱桃绕实蝇在中国的潜在地理分布预测[J].植物保护学报，2019,1:63-70.[6]BatemanMA.Theecologyoffruitflies[J].AnnuRevEntomol,1972,17,493-518.[7]BollerEF,ProkopyRJ.BionomicsandmanagementofRhagoletis[J].AnnualReviewofEntomology,1976,21:223-246.[8]BollerEF,KatsoyannosB,HippeC.HostracesofRhagoletiscerasiL.(Dipt.,Tephritid-ae):Effectofprioradultexperienceonovipositionsitepreference[J].JournalofAppliedEntomology,1998,122(1-5):231-237.[9]DanielC,GrunderJ.IntegratedManagementofEuropeanCherryFruitFlyRhagoletiscerasi(L.):SituationinSwitzerlandandEurope[J].Insects,2012,3(4):956-988.[10]DanielC.EntomopathogenicfungiasanewstrategytocontroltheEuropeancherryfruitflyRhagoletiscerasiLoew(Diptera:Tephritidae)[D].München,Germany:TechnischeUniversitätMünchen,2009.[11]FimianiP.MultilarvalinfestationsbyRhagoletiscerasi(L.)(Diptera:Tephritidae)inche