GB/T 43158-2023 马铃薯黑胫病菌检疫鉴定方法（正式版）

ICSCCS65.020.20马铃薯黑胫病菌检疫鉴定方法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T43158—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草原则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、广州海关技术中心。1GB/T43158—2023马铃薯黑胫病菌检疫鉴定方法本文件描述了马铃薯黑胫病菌的检测和鉴定方法。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文本必不可少的条款。其中，注日期的引用文本文件。SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法本文件没有需要界定的术语和定义。4马铃薯黑胫病菌基本信息菌目(Enterobacteriales)、溶果胶菌科/果胶杆菌科(Pectobacteriaceae)、狄克氏菌属(Dickeya)。马铃薯黑胫病菌的相关信息见附录A。5方法原理以及聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)仪6.1.2培养箱。6.1.4离心机。2GB/T43158—20236.1.5Biolog仪。6.1.6PCR仪。6.1.7实时荧光PCR仪。6.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。7检测流程病菌的分离、鉴定等检测流程如图1所示，检测步骤可分步或同时进行。有症样品有症样品病菌分离PCR检测致病性测试Biolog测试烟草过敏性反应马铃薯黑胫病菌马铃薯黑胫病菌阴性图1检测流程图8检测鉴定按SN/T1157和SN/T2122的规定取样，观察样品上是否有变色和腐烂症状(见附录A)。8.2病菌分离取症状样品病健交界处组织0.1g～0.2g,使用70%酒精表面消毒30s,灭菌水洗3次后转入离心管中，加入1mL灭菌水，浸泡15min,按照附录B规定制作培养基，取浸出液在营养琼脂培养基(NutritionAgarmedium,NA)平板上划线分离；也可将浸出液稀释10倍、100倍和1000倍后分别取100μL涂布NA平板，置于28℃下培养2d~3d后挑取疑似菌落，纯化3次后用于后续试验。典型菌3GB/T43158—2023图2NA培养基上的菌落8.3PCR检测分离物提取脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA),按照附录C的规定进行常规PCR检测或按照附录D的规定进行实时荧光PCR检测，阳性分离物进行后续测试，包括Biolog测试、致病性测试和烟草过敏性反应测试等。8.4Biolog测试(可选)分离物在NA上培养24h后转移至按照附录B要求制作的BUG培养基上，置于30℃下培养24h,按照Biolog使用说明，调整菌悬液浊度加入GENⅢ微孔板中，每孔100μL。30℃下培养18h后8.5致病性测试分离物在NA上28℃培养24h后用灭菌水配成10⁸CFU/mL的菌悬液，针刺接种风信子和马铃薯幼茎，以灭菌水作为对照，28℃光照培养，2d后观察发病情况。风信子接种症状如图3所示，风信子叶片上病斑呈水渍状，病健交界清晰，后期变色软腐；马铃薯接种症状如图4所示，马铃薯茎干迅速变果判断接种分离菌和接种物是否是同种细菌，完成致病性测试。4GB/T43158—2023图4马铃薯上的接种症状(左侧2株：Dickeyasolani;右侧2株：无菌水)分离物在NA上28℃培养24h后用灭菌水配成10⁸CFU/mL的菌悬液，用灭菌注射器针头注入普通烟草叶片背面表皮下，以灭菌水作为对照，28℃光照培养24h～48h,观察烟草是否出现过敏性分离物的菌落形态特征与目标菌相符，常规PCR或实时荧光PCR检测为阳性，且致病性测试为阳性，判定为马铃薯黑胫病菌Dickeyasolani。必要时(实验室首次截获、新寄主、新分布地等),增加Biolog测试和烟草过敏性反应，Biolog测试为Dickeyasolani,能引起烟草过敏性反应，判定为马铃薯黑胫病菌Dickeyasolani。样品置于阴凉干燥处或冰箱中保存6个月。阳性样品至少保存1年，以备复检、谈判和仲裁，样品阳性分离物用30%甘油制成菌悬液，置于一80℃下保存1年；或冻干后于-20℃下保存。5GB/T43158—2023(资料性)病菌基本信息A.1名称及分类地位分类地位：细菌界(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、溶果胶菌科/果胶杆菌科(Pectobacteriaceae)、狄克氏菌属(Dickeya)。A.2地理分布A.3寄主马铃薯(Solanumtuberosum)和风信子(Hyacinthusorientalis)。A.4传播途径病菌主要通过球茎、块茎、花卉、观赏植物等繁殖材料的调运进行远距离传播。田间传播主要是通A.5生物学特征NA培养基上菌落圆形，扁平，边缘略呈波纹状生物3型，产生磷酸酶和吲NA培养基上39℃可生长。A.6症状病菌主要侵染茎基部和薯块，在马铃薯生长期的各个阶段均可发病。病菌主要通过带病的种薯传播，由伤口或茎皮孔侵入组织后发病，导致地下部块茎腐烂与地上部植株茎腐及叶片枯死，如图A.1和图A.2风信子种球上腐烂症状6GB/T43158—2023病重的块茎播种后，种薯不发芽，或刚发芽就烂在土中，不能出苗；有的幼苗出土后病害发展至茎地软化，呈乳白色至棕褐色。腐烂组织边缘呈褐色至黑色，病健组织分界明显，而后扩展致整个块茎腐烂，最后只剩薄薄的外皮。病株的叶片多先从上部叶片发病向下部叶片扩展。发病初期，叶缘变枯干基部中空坏死。7GB/T43158—2023(规范性)培养基的制作要求B.1营养琼脂培养基(NutritionAgarmedium,NA)牛肉浸膏3.0g蛋白胨5.0g琼脂17.0g酵母粉2.0g氯化钠5.0g蒸馏水1000mL调整pH至7.4,121℃湿热灭菌15min。B.2BUG琼脂培养基(BUGagarmedium)BUG琼脂培养基57.0g调整pH至7.4,121℃湿热灭菌15min。B.3金氏B培养基(King's蛋白胨甘油磷酸氢二钾硫酸镁琼脂蒸馏水Bmedium,KB)20.0g调整pH至7.2～7.4,121℃湿热灭菌15min。8GB/T43158—2023(规范性)引物为Ds4(5'-aatgctaacgacggcgta-3')/Ds5(5'-atggtgttgcccaggttctg-3'),源于鞭毛蛋白编码(flagellin-C.2反应体系酸(deoxy-ribonucleosidetriphos上下游引物(引物浓度各为5μmol/L),1μL模板DNA,1.5UTaq聚合酶(5U/μL),加水至25μL。也可使用等效的PCR预混液配制反应体系。以灭菌去离子水作空白对照，以D.solani的DNA作为阳性对照，以同属其他种(如D.chrysanthemi或D.dadantii)DNA作为阴性对照。PCR反应程序：94℃3min;94℃30s,65℃30s,72℃30s,循环35次；最后72℃10min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶1×Tris乙酸盐乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)缓冲液(Trisacetate-EDTAbuffer,TAE)电泳，溴化乙锭(Ethidiumbromide,EB)或核酸9GB/T43158—2023(规范性)实时荧光PCRD.1引物及探针引物Ds4(5'-aatgctaacgacggcgta-3′)/Ds5(5'-atggtgttgcccaggttctg-3),D.3反应条件(温度/时间)D.4结果判定阳性对照、阴性对照和空白对照均正常：GB/T43158—2023[1]SlawiakM,EojkowskaE,VanderWolfJM.FcausedbyDickeyaspp.(syn.Erwiniachrysanthemi)inPoland.PlantPathology.2009,58:794.tatoproductioninEurope.PlantPathology.2011,60(3):385-399.[3]Tsror(Lahkim)L,ErlichO,LebiushS.,etal.AssessmentofrecentoutbreaksofDickeyasp.(syn.Erwiniachrysanthemi)slowwiltinpotatocropsinIsrael.Europthology.2009,123:311-320.plantpathogenicbacteriumisolatedfrompotato(Solanumtuberosum).InternationalJournalofSys-[5]SarrisPF,TrantasE,PagoulatouM,etal.FirstreportofpotatoblacklegcausedbybiovaDickeyasp.(Pe