酶工程酶的生产和分离纯化

关于酶工程酶的生产和分离纯化Contentsofchapter2二、酶的提取与分离纯化技术路线三、细胞破碎四、酶的提取五、酶的分离方法六、酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的生产第2页,共53页，星期六，2024年，5月

1.对酶源的要求

2.微生物作为酶的优势

3.对酶生产菌的要求一、酶的生产动植物、微生物生物合成化学合成第3页,共53页，星期六，2024年，5月1.对酶源的要求

1）酶含量丰富

2）提取、纯化方便一、酶的生产第4页,共53页，星期六，2024年，5月2.微生物作为酶的优势

1）微生物种类多，易得到所需的酶类

2）可以控制微生物培养条件，易获得高产菌株

3）生产成本低

4）微生物繁殖快、生长周期短

5）生产易管理

6）提高微生物产酶能力的途径较多

7）微生物易改造，可提高酶产量或改造酶一、酶的生产第5页,共53页，星期六，2024年，5月3.对酶生产菌的要求

1）不是致病菌，也不产毒素

2）不易变异退化，不易感染噬菌体

3）产酶量高，而且最好产生胞外酶

4）原料廉价，周期短，易培养一、酶的生产第6页,共53页，星期六，2024年，5月主要产酶菌：大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶。因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程菌”。也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、门冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等。枯草杆菌：工业上应用最广泛的产酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等的产酶菌。啤酒酵母：工业上广泛应用，主要产转化酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶等。曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：糖化酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多种酶。第7页,共53页，星期六，2024年，5月细胞结构与酶分布第8页,共53页，星期六，2024年，5月细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。二、酶的提取与分离纯化技术路线第9页,共53页，星期六，2024年，5月酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质

(crudeprotein):采样→均质打破细胞→抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2)部分纯化(partiallypurified):初步的纯化，使用各钟柱层析法。(3)均质酶

(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPLC。酶分离纯化不同阶段第10页,共53页，星期六，2024年，5月许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机三、细胞破碎第11页,共53页，星期六，2024年，5月机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理第12页,共53页，星期六，2024年，5月酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。四、酶的提取第13页,共53页，星期六，2024年，5月提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。四、酶的提取第14页,共53页，星期六，2024年，5月提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。四、酶的提取第15页,共53页，星期六，2024年，5月五、酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离GoGoGoGo5、电泳分离Go第16页,共53页，星期六，2024年，5月1、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离第17页,共53页，星期六，2024年，5月1、沉淀分离沉淀分离方法分离原理有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离第18页,共53页，星期六，2024年，5月在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。

在一定的温度和pH值条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析；而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析。盐析第19页,共53页，星期六，2024年，5月

在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。盐析第20页,共53页，星期六，2024年，5月影响蛋白质盐析沉淀的因素

a.蛋白质的浓度:2.5-3.0%b.介质的pH:接近等电点

c.温度:一般在室温，特殊在4度

d.盐类型:单价盐很差1、沉淀分离盐析第21页,共53页，星期六，2024年，5月

空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。1、沉淀分离PEG沉淀第22页,共53页，星期六，2024年，5月影响因素

a.蛋白质的分子质量——大，沉降好b.蛋白质浓度:浓度高，易于沉淀；太高，分段作用减弱c.pH值:接近等电点d.离子强度:低离子强度影响不大，过高影响分段效果e.温度:0－30度f.PEG聚合度:越高，用量越少；过高操作不便，多用PEG60001、沉淀分离PEG沉淀第23页,共53页，星期六，2024年，5月

有机溶剂之所以能使酶沉淀析出，主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等有机溶剂第24页,共53页，星期六，2024年，5月等电点沉淀法

蛋白质在等电点（ｐI）处，净电荷为0，易于沉淀。热变性沉淀法

可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变性温度提高。1、沉淀分离第25页,共53页，星期六，2024年，5月

离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。2、离心分离第26页,共53页，星期六，2024年，5月低速离心机,

其最大转速在8000r/min以内，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104r/min，在酶的分离中主要用于沉淀细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。超速离心机的最大转速达(2.5～12)×104r/min，超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。2、离心分离第27页,共53页，星期六，2024年，5月区带离心法等密度平衡离心法高速离心法的比较第28页,共53页，星期六，2024年，5月

蛋白质分子在离心时，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降系数即用來描述此沉降性质；其单位为

S(Svedbergunit)。

每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法分离。2、离心分离第29页,共53页，星期六，2024年，5月3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质第30页,共53页，星期六，2024年，5月过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同

)

类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜第31页,共53页，星期六，2024年，5月膜分离加压膜分离微滤超滤反渗透电场膜分离电渗析离子交换膜电渗析扩散膜分离透析第32页,共53页，星期六，2024年，5月4、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数第33页,共53页，星期六，2024年，5月

层析方法分离依据离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶过滤层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化4、层析分离第34页,共53页，星期六，2024年，5月离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换层析第35页,共53页，星期六，2024年，5月按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。第36页,共53页，星期六，2024年，5月凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶过滤层析第37页,共53页，星期六，2024年，5月凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。第38页,共53页，星期六，2024年，5月常用的凝胶：

葡聚糖凝胶

琼脂凝胶与琼脂糖凝胶

聚丙烯酰胺凝胶

第39页,共53页，星期六，2024年，5月亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。亲和层析第40页,共53页，星期六，2024年，5月酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.亲和层析第41页,共53页，星期六，2024年，5月根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：

共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析

第42页,共53页，星期六，2024年，5月5、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。第43页,共53页，星期六，2024年，5月5、电泳分离颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。第44页,共53页，星期六，2024年，5月5、电泳分离聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦第45页,共53页，星期六，2024年，5月SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）加入1%~2%的SDS制备而成。

SDS－PAGE主要用于测定蛋白质的分子质量。基本原理：

SDS－蛋白质复合物中SDS含有大量阴