酶工程酶的固定化

关于酶工程酶的固定化酶和细胞的固定化固定化酶概述问题的提出：游离酶的不足之处酶的稳定性问题在温度、pH和无机离子等外界因素的影响下，酶的稳定性不佳，半衰期较短，容易变性失活酶的重复使用的问题在均相体系中的酶催化反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难以回收利用，成本较高，不便连续化生产产物分离纯化的问题酶反应后成为杂质与产物混在一起，增加分离纯化的困难，尤其是大分子产物第2页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化固定化酶概述游离酶的改进思路设计一种方法，将酶束缚于特殊的相（固定化），使它与整体分开，但仍能进行底物和效应物的分子交换固定化酶（Immobilizedenzyme）的概念固定在一定载体

上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶固定化酶可像一般化学反应中的固相催化剂一样，既有酶催化特性，又有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，可使生产工艺连续化、自动化固定化酶克服游离酶的不足之处，增加酶的稳定性，使昂贵的酶能重复使用第3页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化固定化酶概述固定化生物催化剂固定化酶固定化死细胞（微生物菌体）固定化活细胞（增殖细胞）固定化植物细胞固定化动物细胞固定化原生质体固定化酶是一个广义的概念！第4页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化固定化酶概述固定化酶的优点提高酶稳定性，可反复或连续使用，提高使用效率，降低成本易于和反应产物分开，产物溶液无酶残留，简化提纯工艺酶反应过程可严格控制较游离酶更适合多酶反应增加产物收率，提高产物质量固定化酶的缺点固定化时酶活有损失增加了生产初始成本只能用于可溶性底物且较小分子，催化过程受传质因素的限制一般适用于胞外产物，而胞内产物分离较困难第5页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化固定化酶概述固定化酶的发展简史1916年，Nelson和Griffin（美）发现吸附在骨碳上的蔗糖酶仍显示催化活力——最早的固定化酶（吸附法）1953年，Grubhofer和Schleith（德）用重氮化聚氨基苯乙烯树脂固定化水解酶（共价结合法）1969年，千畑一郎（日）采用固定化氨基酰化酶，从DL-氨基酸消旋混合物中连续拆分生产L-氨基酸——固定化酶的首次工业规模应用，并促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱离出来1971年，第一次国际酶工程会议确定“固定化酶”的统一英文名称为ImmobilizedEnzyme第6页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化固定化酶概述固定化酶的发展简史1973年，日本首次在工业上成功应用固定化E.coli

菌体中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天冬氨酸——首次报道固定化细胞的应用1976年，法国用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精1978年，日本用固定化B.subtilis

细胞生产淀粉酶——固定化细胞产酶的先例1979年，固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功——固定化植物细胞技术的突破1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸——固定化原生质体技术诞生第7页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化固定化酶概述固定化酶的专著Carrier-boundImmobilizedEnzymes:Principles,ApplicationsandDesignWrittenbyLin-QiuCao《载体固定化酶——原理、应用和设计》杨晟，袁中一译，化学工业出版社，2008第8页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化本章内容酶的固定化酶的固定化方法（重点）固定化酶的性质（重点）固定化酶的反应动力学简述（补充内容）固定化酶的应用细胞的固定化细胞固定化方法（重点）微生物细胞固定化植物细胞固定化动物细胞固定化原生质体的固定化第9页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化几个概念固定化酶（immobilizedenzyme）水不溶酶（waterinsolubleenzyme）固相酶（solidphaseenzyme）酶的固定化（enzymeimmobilization）制备“固定化酶”的过程，即将酶或菌体与不溶性载体结合的过程固定化采用的酶的类型粗酶，或是提纯后的酶结合在菌体或细胞碎片上的酶/酶系（固定化菌体）第10页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶制备原则维持酶的催化活性及专一性应有利于生产自动化、连续化应有最小的空间位阻酶与载体必须结合牢固稳定性好载体具有惰性成本尽可能低固定化酶制备的原则第11页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法第12页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法第13页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法（重点）包埋法物理吸附法离子结合法共价结合法交联法其他方法固定化方法的比较▲第14页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等第15页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——包埋法凝胶包埋法天然凝胶天然多糖及其衍生物特点：条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差合成凝胶合成聚合物材料，如聚丙烯酰胺特点：强度高，对环境的耐受性好，但要依靠聚合反应进行包埋，酶活有一定损失适用性不适用于底物或产物分子很大的酶的固定化第16页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——包埋法聚丙烯酰胺凝胶的合成与酶的包埋——网格型第17页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——包埋法半透膜包埋法（微胶囊）微胶囊材料：聚酰胺膜、火棉胶膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小适用性：底物和产物都是小分子的酶微胶囊制备方法界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而成膜析出界面聚合法：亲水性单体+疏水性单体在界面发生聚合脂质体包埋法：类似于“细胞质膜”式的结构聚电解质络合法：如海藻酸钠与聚赖氨酸通过静电作用结合其他方法，如自组装法等第18页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——包埋法微胶囊制备过程——界面聚合法第19页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——物理吸附法利用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法是一种可逆的物理方法结合力：依靠分子间力结合，作用力弱，酶易脱落操作条件：条件温和，酶不发生变性载体材料无机载体：活性炭、多孔玻璃、高岭土、氧化铝、羟基磷灰石等有机载体：多糖类凝胶、大孔吸附树脂等第20页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——离子结合法非共价结合法的一种，是通过酶分子与载体之间的静电引力

相结合可以采用填充柱式操作特点静电作用力的强度比范德华力强，因此，通过离子结合法得到的固定化酶的稳定性好于物理吸附法结合的酶量具有最大值（饱和性）对pH值、离子强度变化较敏感，在高盐条件下不稳定，酶容易被洗脱第21页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——离子结合法所用的载体材料一般为合成的离子交换剂阴离子型：DEAE-纤维素/葡聚糖、TEAE-纤维素等阳离子型：羧甲基纤维素（CMC）、Dowex系列阳离子交换树脂（如Dowex-50等）第22页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——共价结合法通过共价键

将酶与载体结合的固定化方法，是载体结合法中报道最多的方法载体材料的选择天然有机载体多糖（琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、甲壳素等）蛋白质、细胞刚性无机物：玻璃、陶瓷、硅胶合成聚合物：聚酯、聚酰胺（如聚赖氨酸）、尼龙酶分子中用于共价连接的基团氨基、羧基、巯基、羟基第23页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——共价结合法共价结合过程（对照：酶的大分子修饰）载体活化：载体上引入活泼基团偶联：活化后的载体通过活泼基团与酶分子中的特定基团连接

——避免活性中心的基团被偶联共价结合的优点共价结合牢固，酶很难脱落，可长时间使用缺点共价结合可能影响酶的空间构象，从而影响酶的催化活性操作较繁琐第24页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——共价结合法载体活化和偶联反应：(1)含氨基载体第25页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——共价结合法载体活化和偶联反应：(2)含羧基载体（如CMC）琥珀酰亚胺第26页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——共价结合法载体活化和偶联反应：(2)含羧基载体（如CMC）第27页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——共价结合法载体活化和偶联反应：(3)含羟基载体（多糖类）第28页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——共价结合法载体活化和偶联反应：(3)含羟基载体（多糖类）第29页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——共价结合法载体活化和偶联反应：(4)含硅无机载体方法一：在载体表面包覆一层有机层（如琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、白蛋白等），或用表面聚合的方法“镀上”一层聚合物，再对包覆后的表面进行活化处理方法二：利用有机硅试剂直接活化硅羟基第30页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法可以用于含酶菌体或菌体碎片的固定化常用的交联试剂戊二醛（glutaraldehyde）己二胺（hexamethylenediamine）顺丁烯二酸酐（maleicanhydride）第31页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——交联法酶分子之间的交联酶与水不溶性载体的交联（区别于共价结合法）第32页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——交联法酶分子间的戊二醛交联：氨基的交联反应交联时的pH值一般与酶的等电点pI相同第33页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——交联法酶与载体交联：采用交联剂将酶分子偶联到水不溶性载体上，形成水不溶性的固定化酶第34页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——交联法交联得到的固定化酶/固定化菌体结合牢固，酶很难脱落，可长期使用交联反应条件剧烈，而且交联需酶分子中的多个基团同时参与，致使酶活力损失较大双重固定化法包埋+交联吸附+交联第35页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法——其他方法热处理法：选择性热变性将含目标酶的细胞在一定温度下加热处理一段时间，使细胞膜蛋白和细胞内大多数酶变性而保留目标酶活性制得的固定化菌体仅适用于热稳定性较好的酶控制温度和时间，以防过热例：含葡萄糖异构酶的链霉菌菌体在60～65oC温度下处理15min，葡萄糖异构酶全部固定在菌体内热处理法也可与交联法及其他固定化方法联用，进行双重固定化第36页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化方法的比较特征载体结合法交联法包埋法离子结合法物理吸附法共价结合法制备易易难中较难结合力中弱强强强酶活性高高中或低低高载体再生性较容易容易难不能再生不能再生底物专一性不变不变可变可变不变稳定性中低高高高固定化成本低低高中中或高抗微生物能力无无无可能较强第37页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的性质——稳定性热稳定性一般会得到提高，可耐受较高温度，但无规律可循保存稳定性好，保存时间延长对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶降解对变性剂（如尿素、有机溶剂、盐酸胍等）的耐受性提高，能保留较高酶活力对酶抑制剂、对不同pH值的稳定性提高稳定性提高第38页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的性质——最适温度与游离酶相比，固定化酶的最适温度一般变化不大部分酶固定化后最适温度发生明显变化例1：利用重氮化法制备固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，最适温度比游离酶高出5～10oC例2：色氨酸酶与载体共价结合之后，最适温度比游离酶高5～15oC采用不同方法固定化同一种酶，最适温度也可能不同例：氨基酰化酶（游离酶最适60oC）用DEAE-葡聚糖凝胶为离子结合载体得到的固定化酶最适温度为72oC；用DEAE-纤维素结合后，最适温度为67oC；用烷基化共价结合后，最适温度比游离酶有所下降第39页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的性质

——最适pH值（难点）酶固定化后最适pH值一般会发生变化产物性质的影响——积累效应酸性产物：最适pH

碱性产物：最适pH

载体性质的影响——吸附效应带负电载体：最适pH

带正电载体：最适pH取决于微环境第40页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的性质——最适pH值载体性质的影响——原因：正负离子之间的相互吸引作用第41页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的性质——底物特异性固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有关作用于低分子量底物的酶，特异性无明显变化（如氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶等）既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，特异性往往会发生变化例：固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或短肽的作用保持不变，而对酶蛋白的降解活力仅为游离酶的3%左右原因载体的空间位阻作用，大分子底物难于接近酶分子第42页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化小结：影响固定化酶性能的因素酶的因素：主要是活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化载体因素：在固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起的变化主要的影响质量传递效应载体产生的（静态）和反应产生的（动态）质子梯度固定化酶的稳定性和产率第43页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化影响固定化酶性能的因素——质量传递效应酶的固定化意味着酶的机动性受到精确限制，从而影响溶质的运动性能，这种现象即质量传递效应反应速率的降低是由于载体材料表面内外的扩散限制造成的加强质量传递的一些措施降低载体颗粒的大小：小颗粒具有较大的比表面积，可以加快分子和载体之间的接触速率；粒径下限一般为100m加强反应体系的混合：通过加强搅拌、通气等方式减小传质阻力酶与载体结合时，尽可能结合在载体的外部，可以减小扩散的阻力，对大分子底物尤其适用第44页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化影响固定化酶性能的因素——质子梯度pH迁移现象：固定在离子交换载体上的固定化酶的最适pH可能迁移3～4个pH单位，这主要是由溶质分子的带电基团和带电载体的静电相互作用（分配作用）引起的水解反应中，当固定化酶释放质子时能观察到动态的质子梯度，如酯的水解；通过不断加入碱，使之扩散入载体，从而减小pH迁移使用具有足够大容量的缓冲体系来减少动态pH梯度影响固定化酶性能的因素——固定化酶稳定性和产率选择最有利于固定化酶保持稳定的固定化方式第45页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化影响固定化酶动力学特征的主要因素空间效应（构象效应和位阻效应）构象效应：由于酶与载体间的共价键作用，引起酶活性部位发生扭曲和变形，改变活性部位的三维结构，导致酶活力下降位阻效应（屏蔽效应）：载体结构上的某些不良特征致使酶的活性部位难以与底物接触，给酶活性部位造成空间障碍分配效应由于载体的亲水性、疏水性、静电作用等原因，使得底物、产物等在微环境与宏观体系间发生不对等分配，从而改变反应体系的组成平衡，影响酶催化效率扩散限制效应指底物、产物及其他效应物的迁移和转运速率受到限制分为外扩散限制和内扩散限制第46页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述第47页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述载体表面固定化酶的动力学外扩散限制载体可视为无孔介质，因此无内扩散载体颗粒内部的扩散－反应方程同时存在外扩散和内扩散问题，情况较复杂，如微胶囊球形颗粒（最常见）圆柱形颗粒薄片形（较少见）第48页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述载体表面固定化酶的传质过程步骤1：底物从液相主体扩散到载体外表面步骤2：底物在载体外表面进行反应，生成产物步骤3：产物从外表面扩散进入液相主体Nernst扩散膜邻近载体表面处存在一液体滞流膜（假想），扩散阻力集中于该膜内，产生相应的浓度梯度第49页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述载体表面固定化酶外扩散限制时的表观反应速率底物由液相主体扩散到载体外表面的速率为rd——底物从液相主体扩散到载体表面的速率，mol·L-1·s-1KL——底物传质系数，m·s-1a——传质比表面积，m-1c0——底物在液相主体中的浓度，mol·L-1ci——底物在载体表面的浓度，mol·L-1(6-1)第50页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述载体表面固定化酶外扩散限制时的表观反应速率设底物的酶促反应速率符合Michaelis-Menten方程，则其在固定化酶外表面处的表观反应速率ri（mol·L-1·s-1）为稳态条件下，rd=ri，即式(6-3)表示稳态条件下，底物外扩散速率等于固定化酶外表面处的反应速率(6-2)(6-3)第51页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述载体表面固定化酶外扩散限制时的表观反应速率引入无因次量则式(6-3)可改写为cS——无量纲底物浓度K——无量纲米氏常数Da——Damköhler准数（无量纲）(6-4)(6-5)第52页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述载体表面固定化酶外扩散限制时的表观反应速率解式(6-5)得其中，Da

为一重要参数（Damköhler准数），其物理意义为当Da<<1时，过程为反应速率控制，ci=c0，ri=r0当Da>>1时，过程为扩散速率控制，ci≈0，ri=KLa·c0(6-6)(6-7)(6-8)第53页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述载体颗粒内部固定化酶的传质过程步骤1：底物从液相主体穿过液膜扩散到载体（胶囊）的外表面步骤2：底物穿过胶囊微孔，进入胶囊内部，与酶分子接触步骤3：底物在胶囊内被酶分子催化发生反应，生成产物步骤4：产物穿过胶囊微孔，排出胶囊步骤5：产物穿过液膜，从胶囊外表面扩散进入液相主体第54页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述球形载体颗粒内的扩散－反应方程对微胶囊的球壳作底物质量衡算，在稳态下有整理得到边界条件为(6-9)(6-10)(6-11)第55页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述球形载体颗粒内的扩散－反应方程底物利用的总速率为将式(6-10)、(6-11)无因次化，定义整理，并应用Michaelis-Menten方程得到(6-12)(6-13)(6-14)(6-15)第56页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述球形载体颗粒内的扩散－反应方程式(6-14)中的

和

分别定义为定义有效因子

：用无因次量表示为(6-16)(6-17)(6-18)第57页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述球形载体颗粒内的扩散－反应方程对于固定化酶，米氏方程中的rmax

和Km

不一定知道，因此为避免计算困难，通过下述方法消去rmax：对式(6-19)中的可测量变量用

定义：由此可知，

只是

和

的函数，即(6-19)(6-20)(6-21)第58页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述对球形载体颗粒内的扩散－反应方程的讨论——情形1当

很大（如

3）且符合Michaelis-Menten方程时，底物的扩散速率要比反应速率慢得多，总反应速率受扩散控制，式(6-10)中的一阶导数项可以忽略，则式(6-10)变为改写为(6-22)(6-23)第59页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述对球形载体颗粒内的扩散－反应方程的讨论——情形1对cS

积分可得由式(6-12)、(6-17)得到

的表达式为式(6-25)为

的解析解(6-24)(6-25)第60页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述对球形载体颗粒内的扩散－反应方程的讨论——情形2当cS<<Km

时，Michaelis-Menten方程分母中的cS

可以忽略，因此转化为一级动力学：这时，扩散反应方程式(6-14)、(6-15)变为(6-26)(6-27)(6-28)第61页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述对球形载体颗粒内的扩散－反应方程的讨论——情形2方程(6-27)、(6-28)的解析解为由此可得根据

的定义，且当

=0时，(6-29)(6-30)(6-31)第62页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述对球形载体颗粒内的扩散－反应方程的讨论——情形3当cS>>Km

时，Michaelis-Menten方程转化为零级动力学：因此扩散－反应方程式(6-10)变为结合边界条件，方程(6-33)的解析解为式(6-34)满足的条件为cS

0(6-32)(6-33)(6-34)第63页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的反应动力学简述对球形载体颗粒内的扩散－反应方程的讨论——情形3要保证cS

0，因此从r=R

向内直至临界半径Rc(此时cS

=0)，式(6-34)均成立。临界半径有下式给出：此时的有效因子

表示为显然，当Rc=0时，

=1(6-35)(6-36)第64页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用固定化酶在工业生产中的应用在工业上，固定化酶主要用于手性合成、手性拆分等有机化合物的合成酶传感器及其应用环境监测、临床诊断等固定化酶在药物控释载体方面的应用利用固定化酶稳定性较好的特点延长药用酶的半衰期，增大药用酶的生物利用度第65页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——工业应用氨基酰化酶（aminoacylase，EC3.5.1.14）世界上第一种工业化生产的固定化酶1969年，日本田边制药公司用DEAE-葡聚糖凝胶通过离子结合法固定化氨基酰化酶，可以催化乙酰氨基酸的脱乙酰反应，用于拆分DL-乙酰氨基酸外消旋体：采用固定化氨基酰化酶，生产成本只有游离酶的60%第66页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——工业应用DL-乙酰氨基酸的工业化连续拆分工艺第67页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——工业应用葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphateisomerase,EC5.3.1.9)全世界生产规模最大的固定化酶，1973年即实现工业生产将培养好的含葡萄糖-6-磷酸异构酶的放线菌细胞60～65oC热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶葡萄糖-6-磷酸异构酶催化葡萄糖-6-磷酸异构化生成果糖-6-磷酸，可用于连续生产果葡糖浆第68页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——工业应用天冬氨酸酶（aspartase，EC4.3.1.1）1973年，日本用聚丙烯酰胺凝胶为载体，将具有高活性天冬氨酸酶的E.coli

菌体包埋制得固定化酶，将延胡索酸转化生产L-天冬氨酸：1978年，改用角叉菜胶为载体制备固定化天冬氨酸酶第69页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——工业应用青霉素酰化酶（penicillinacylase，EC3.5.1.11）在医药工业上广泛使用的一种酶，1973年已用于工业化生产，用于制造半合成青霉素和头孢菌素第70页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——工业应用延胡索酸酶（fumarase，EC4.2.1.2）用聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体，于1974年实现工业化生产，从延胡索酸生产苹果酸1977年以后，改用角叉菜胶包埋具有高活性延胡索酸酶的黄色短杆菌菌体，其L-苹果酸产率比前者提高5倍第71页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——工业应用其他酶的工业应用实例

-半乳糖苷酶固定化

-半乳糖苷酶于1977年实现工业化生产，催化乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，用于制造低乳糖乳品天冬氨酸-

-脱羧酶将含此酶的假单孢菌菌体用凝胶包埋法制得固定化酶，催化L-天冬氨酸脱羧基生成L-丙氨酸脂肪酶已有多种脂肪酶用于工业化生产，可催化甘油三酯水解以及转酯反应、酯化反应、多肽合成、手性拆分等多种反应，用途广泛第72页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——酶传感器酶传感器：由固定化酶与能量转换器组合而成的传感装置，属于生物传感器的一种酶电极——最常见的酶传感器由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置1962年Clark和Lyons提出酶电极模型1967年Updike和Hicks首先制得酶电极，用于葡萄糖的定量分析第73页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——酶传感器生物传感器（biosensor）概述用生物活性材料（酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）与物理、化学传感器有机结合，是一种先进的检测方法与监控手段，也是物质分子水平的快速、微量分析方法我国的生物传感器的研究起步于70年代末期，早期研究普遍采取氧电极作生物反应中的换能器，以葡萄糖氧化酶为活性材料第74页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——酶传感器生物传感器的应用第75页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——酶传感器生物传感器的组成和工作原理传感器能将一种被测信号（参量）转换成一种可输出信号，由感受器、换能器、电子线路组成选择测定的基础——以分子识别部分去识别被测目标，是可以引起某种物理变化或化学变化的主要功能元件这些分子识别功能物质通过识别过程可与被测目标结合成复合物（如抗体和抗原的结合，酶与底物的结合等）在设计生物传感器时，选择适合于测定对象的识别功能物质，要考虑到所产生的复合物的特性根据分子识别功能物质制备的敏感元件所引起的化学变化或物理变化，选择合适的换能器第76页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——酶传感器例：葡萄糖氧化酶电极用聚丙烯酰胺凝胶包埋葡萄糖氧化酶，制成厚度为20～50m的酶膜，再与氧电极及聚四氟乙烯高分子薄膜紧密结合，组成葡萄糖氧化酶电极使用时，使酶电极进入样品溶液中，样品中的葡萄糖扩散到酶膜中，在氧气的存在下被酶催化氧化生成葡萄糖酸内酯，由氧电极测得的氧浓度变化，可知葡萄糖浓度第77页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——酶传感器例：青霉素（酰化）酶电极利用固定化青霉素酰化酶的酶膜与pH电极结合而成将青霉素酰化酶固定在聚丙烯酰胺凝胶或光交联树脂膜内，然后紧贴在玻璃电极上制成酶电极浸入含青霉素的溶液中时，青霉素酰化酶催化青霉素水解生成氨基青霉烷酸，导致溶液中H+

浓度增加，可通过pH电极检测第78页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——药物控释载体药物在临床上应用不顺利的原因药物在体内被降解，如口服蛋白类药物被胃酸或消化道的蛋白酶所分解药物易被肝和血液中的酶系统清除，需反复注射给药药物使用引起机体本身毒副作用某些药物亲水性强，难以透过细胞质膜蛋白质类药物容易引起免疫反应很多药物稳定性差，不易储存解决：开发药物新剂型，开发新型的药物控释载体第79页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——药物控释载体将药物（药用酶）与聚合物载体偶联或固定于某种聚合物载体上，成为载体药物聚合物修饰如：羧甲基壳聚糖修饰修饰天冬酰胺酶凝胶包埋用生物相容性好的高分子聚合物与药物混合制成含有药物的凝胶，植入体内特定部位，达到缓释的效果例：将能够表达促红细胞生成素（EPO）的工程细胞株包埋后植入组织中，达到缓释EPO的效果第80页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化酶的固定化固定化酶的应用——药物控释载体载体药物微球制剂用聚合物微球包埋或化学偶联药物制成微球制剂，与靶细胞接触，通过胞饮作用进入细胞内例如，以生物可降解材料包埋人生长激素，注射后不产生免疫排斥反应脂质体磷脂双分子层在水溶液中自发形成的超微型中空小泡，和细胞质膜具有类似的“双层膜”结构第81页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化固定化细胞的概念固定在载体上，并在一定空间范围内进行生命活动的细胞称为“固定化细胞”固定化细胞是活的细胞，具有所有的细胞生理活动特征细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力微生物细胞、植物细胞、动物细胞均可制成固定化细胞通过各种方法，将细胞固定在水不溶性载体上，制备固定化细胞的过程称为“细胞固定化”第82页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化固定化细胞的主要特点优点可增殖，可获得高度密集的工程菌集合体，细胞密度大发酵稳定性好，可长时间反复连续使用，可采用反应柱连续生产保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，更稳定，对多步催化转化优势更加明显，无需辅酶再生缺点细胞内多酶的存在会形成不需要的副产物细胞膜、细胞壁和载体等都存在扩散限制作用载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性第83页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化固定化细胞的分类第84页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化细胞固定化方法固定化酶和固定化细胞都是以酶的应用为目的，其制备方法和应用方法也基本相同但应用于酶固定化的某些方法通常不用于细胞的固定化，如化学交联法等细胞固定化的常用方法吸附法包埋法其他方法——自凝集法第85页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化细胞固定化方法——吸附法吸附剂：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、金属丝网、微载体和中空纤维等吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法很多动物细胞具有贴壁依赖性，能够很好地附着在容器壁、微载体等载体表面，黏附较牢固很多微生物细胞在载体表面不能牢固结合，容易脱落利用中空纤维制备固定化植物细胞和动物细胞，具有较好的应用前景，但成本较高第86页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化细胞固定化方法——吸附法吸附法固定化细胞实例细胞载体用途备注酵母多孔陶瓷或塑料酒精、啤酒生产pH3～5条件下吸附活性污泥硅藻土、多孔玻璃、陶瓷或塑料有机废水处理沉积吸附霉菌多孔塑料、金属丝网有机酸和酶生产菌丝体植物细胞中空纤维、泡沫塑料生产色素、香精、药物和酶等动物细胞容器壁、微载体或中空纤维外壁生产药用蛋白贴壁依赖型细胞第87页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化细胞固定化方法——包埋法凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种细胞（微生物、植物、动物）细胞被包埋后，被限制在凝胶微孔内进行生长、繁殖和代谢凝胶载体天然材料——琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶合成材料——聚丙烯酰胺、光交联树脂……第88页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化细胞固定化方法——包埋法载体操作过程成型条件特点或注意事项琼脂琼脂水溶液冷却至48~55oC加入细胞悬浮液迅速混匀趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯液中机械强度较差、氧气、底物、产物扩散较困难海藻酸钙海藻酸钠水溶液灭菌冷却后与细胞或孢子悬浮液混匀用注射器或滴管滴入CaCl2

溶液操作简便，条件温和对细胞无毒；磷酸盐会破坏凝胶结构角叉菜胶水溶液灭菌冷却至35~50oC与细胞悬浮液混匀趁热滴到预冷的KCl溶液中具备一定机械强度，操作简便，通透性能较好，对细胞无毒害第89页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化细胞固定化方法——包埋法载体操作过程成型条件特点或注意事项明胶明胶悬浮液加热溶化、灭菌，冷却至35oC以上，与细胞悬浮液混匀冷却凝集后做成所需的形状机械强度不够时用戊二醛交联剂交联丙烯酰胺+甲叉丙烯酰胺两种单体与细胞悬浮液混匀加入过硫酸铵和TEMED混合后静置聚合机械强度高；丙烯酰胺单体对细胞有一定毒害，尽量缩短聚合时间光交联树脂预聚物+光敏剂+水加热至50oC溶解与细胞悬浮液混匀摊成薄片，UV照射3min左右，无菌条件下切成块机械强度高，固定化快，对细胞生长等无明显影响第90页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化细胞固定化方法——自凝集法自凝集法是依靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞，是细胞特有的固定化方法（尤其是丝状微生物），也称“无载体法”某些放线菌和丝状真菌在液体培养时，由于振荡，自身菌丝体间容易相互缠绕而发生自凝集，形成（微）球状菌落有时需要加入助凝剂例如：含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞经柠檬酸处理，再加絮凝剂脱乙酰甲壳素，获得的菌体干燥后即得固定化细胞第91页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化微生物细胞固定化——特点固定化微生物细胞保持了细胞完整结构和天然状态，可以进行正常的生长繁殖固定化微生物细胞完整地保持着细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控系统，可以按照原有的代谢途径进行所需产物的合成与调控稳定性好，可反复使用有效地提高细胞密度由于有载体的保护，基因工程菌的稳定性得到较大提高第92页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化微生物细胞固定化——应用生化产品的生产：能分泌到细胞外的产物含酒精的产品：各种酒的制造氨基酸：Glu、Lys、Arg、Trp、Ile等有机酸：苹果酸、柠檬酸、乳酸、葡萄糖酸等酶：主要是水解酶类，如淀粉酶、蛋白酶等辅酶：辅酶A、NADH、NADPH、ATP等抗生素（种类繁多）其他工业应用甾体药物生产与转化废水处理……第93页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化微生物细胞固定化——应用微生物传感器由固定化微生物细胞与各种能量转换器密切结合而成的传感装置呼吸活性测定型利用固定在高分子膜上的微生物细胞的呼吸作用，通过测定测定O2

的消耗和CO2

的生成，从而确定被测物质的量由固定化微生物膜和氧电极/CO2

电极结合而成电极活性测定型利用固定在膜上的微生物细胞的新陈代谢作用，通过测定电极活性物质的量的变化，从而确定样品中欲测物质的含量由固定化微生物膜与生物燃料电池、离子选择电极和气体电极等组成第94页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化微生物细胞固定化——应用微生物电极及其特性（表1）被检测物微生物种类电极检测范围(mg·mL-1)感应时间(min)葡萄糖荧光假单孢杆菌氧电极3×10-3～2×10-210糖乳酸发酵短杆菌氧电极2×10-2～10-110乙酸腌菜丝孢酵母氧电极10-2～2×10-115氨硝化细菌氧电极3×10-3～5×10-25甲醇（未鉴定）氧电极3×10-3～10-215乙醇腌菜丝孢酵母氧电极3×10-3～10-215制霉菌素啤酒酵母氧电极8×10-3～10-160致癌物枯草芽孢杆菌氧电极10-3～10-260BOD多孢丝孢酵母氧电极3×10-3～10-210甲烷甲基单孢菌氧电极2×10-4～10-10.5第95页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化微生物细胞固定化——应用微生物电极及其特性（表2）被检测物微生物种类电极检测范围(mg·mL-1)感应时间(min)细胞群体/燃料电池10-3～10815维生素B1发酵乳杆菌燃料电池10-6～10-5(mL-1)360甲酸丁酸羧菌燃料电池10-2～210头孢菌素弗氏柠檬酸杆菌pH电极6×10-2～5×10-110烟酸阿拉伯糖乳杆菌pH电极5×10-3～10-160精氨酸屎链球菌氨电极10-2～2×10-110天冬氨酸短杆菌氨电极5×10-4～10-15赖氨酸大肠杆菌CO2

电极10-2～10-15谷氨酸大肠杆菌CO2

电极8×10-3～10-15谷氨酰胺黄色叠球菌氨电极2×10-2～15第96页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化植物细胞固定化植物细胞固定化技术是20世纪70年代发展起来的技术，为工业化生产天然产物提供了新的途径1979年，海藻酸钙固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功植物细胞体积大，对剪切力较敏感，生产周期长，易聚集成团，发酵生产稳定性较差，产率不高，对植物细胞进行固定化之后，可以改进上述问题植物细胞固定化之后，可以采用连续培养的操作方式，能够连续地生产目标产物第97页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化植物细胞固定化——中空纤维固定化将植物细胞置于中空纤维的外壁与外壳容器的内壁之间，让细胞吸附在中空纤维外壁上培养液及O2

可在中空纤维的管内流动，并透过半透膜管壁传递给外壁上的细胞经植物细胞代谢后的产物又通过中空纤维膜进入管内，随培养液流出优点近乎于植物体内物质的传递与交换方式，有利于细胞的生长和代谢的进行缺点有时纤维管会因阻塞而影响传质成本较高，难以大规模应用第98页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化植物细胞固定化——应用（表1）植物细胞固定化方法产物罂粟藻酸盐可待因酮

可待因澳洲茄聚苯氧化物甾类糖苷生物碱海巴戟藻酸盐蒽醌辣椒泡沫塑料辣椒素薰衣草藻酸盐蓝色素甜菜尼龙片

-花青素大豆中空纤维酚类唐松草藻酸盐小檗碱甘草藻酸盐反查尔酮烟草Xanthan/聚丙烯酰胺生物碱藻酸盐烟碱第99页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化植物细胞固定化——应用（表2）植物细胞固定化方法产物长春花琼脂糖Cathenamine

阿吗碱异构物琼脂或明胶色氨酸

阿吗碱藻酸盐色氨酸

阿吗碱蛇根碱藻酸盐/聚丙烯酰胺阿吗碱Xanthan/聚丙烯酰胺蛇根碱毛地黄藻酸盐毛地黄毒苷

地高辛甲基毛地黄毒苷

甲基地高辛胡萝卜藻酸盐毛地黄毒苷配基

杠柳毒苷配基芰毒配质

5

-羟基芰毒配基薄荷聚丙烯酰胺薄荷酮

新薄荷醇长叶薄荷酮

异薄荷酮第100页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化动物细胞固定化应用生物制药：多肽类激素、细胞因子、疫苗、药用蛋白的生产组织工程：人造皮肤、软骨，以及其他组织和器官动物细胞游离培养存在的问题动物细胞体积大，没有细胞壁保护，培养过程易受剪切力等外界因素影响生长缓慢，培养基组分复杂、昂贵，产率不高解决方法——动物细胞固定化贴壁依赖型细胞：细胞容易附着在载体表面生长，形成细胞集落，传代培养时需用蛋白酶消化悬浮细胞：非贴壁依赖型，一般无附着特性第101页,共113页，星期六，2024年，5月细胞的固定化动物细胞固定化——贴壁依赖型细胞转瓶法玻璃或塑料材质，内表面经处理后带电荷，增强细胞的黏附能力比表面积较小，细胞生长繁殖受到限制；可在转瓶内加进列管或多层平板，增大黏附面积微载体由带负电表面电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等制成，直径一般为10～200m比表面积大，对细胞生长和物质传递有利中空纤维操作方式同植物细胞固定化酶和细胞的固定化第102页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化细胞的固定化动物细胞固定化——悬浮细胞凝胶包埋琼脂糖凝胶包埋：琼脂糖加热融化，冷却后与动物细胞混合，分散在石蜡油中，降温至10oC左右，得到微球状固定化细胞海藻酸钙凝胶包埋：动物细胞与海藻酸钠溶液混合，用注射器将其滴到CaCl2

溶液中，形成固定化细胞血纤维蛋白包埋：动物细胞与血纤维蛋白原混合，加入凝血酶，使血纤维素蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白半透膜包埋海藻酸钙/聚赖氨酸（ALG-PLL）包埋：动物细胞用海藻酸钙凝胶包埋后，用聚赖氨酸处理，在胶囊外层包覆聚赖氨酸膜，而后浸泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解第103页,共113页，星期六，2024年，5月酶和细胞的固定化原生质体固定化原生质体固定化的意义固定化原生质体固定在载体上，并在一定空间范围内进行新陈代谢的原生质体固定化细胞的缺陷：细胞壁对传质的阻碍只能够生产胞外酶和其它能够分泌到细胞外的产物由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制在好氧发