TSPPHN 005-2024 2.0 亿CFUmL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂

ICS01.040.65CCSB15/19湖南省植物保护学会团体标准T/SPPHN005-20242.0 PSB-SRhodopseudomonaspalustrisPSB-S2.0×108CFU/mLSC2024-06-05发布 2024-06-05实施湖南省植物保护学会 发布T/SPPHN005-2024T/SPPHN005-2024II前 言本文件是根据GB/T1.1-20201本文件由湖南省植物保护学会提出。本文件由湖南省植物保护学会归口。本文件主要起草人：刘勇、张德咏、周波、戴建平、史晓斌、张松柏、苏品、张建华。T/SPPHN005-2024T/SPPHN005-2024PAGEPAGE102.0亿CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S范围2.0CFU/mLPSB-S本标准适用于以沼泽红假单胞菌活菌体加工而成的悬浮剂。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T1601pH值的测定方法GB/T1604商品农药验收规则GB/T1605-2001商品农药采样方法GB/T3796农药包装通则GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T28136-2011农药水不溶物测定方法GB/T14825-2006农药悬浮率测定方法GB/T31737-2015农药倾倒性测定方法GB/T28137-2011农药持久起泡性测定方法GB/T16150-1995农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法要求组成与外观本品为红色液体，有轻微臭味，存放过程中可能出现轻微沉淀，但经摇匀后应恢复原状。1表1 2.0亿CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂控制项目指标项目技术指标有效活菌数∕CFU/mL≥2.0×108杂菌率∕(%)≤10水不溶物质量分数∕(%)≤0.2pH值6.5～8.5悬浮率（有效成分）/（%）≥80倾倒性倾倒后残余物/（%）≤5.0洗涤后残余物/（%）≤0.5持久起泡性（1min后泡沫量）/mL≤1.0细度（75μm）/（%）≥98稀释稳定性合格低温稳定性a)合格热贮稳定性b)合格注：a)，b)低温稳定性、热贮稳定性实验，在正常生产时每3个月至少进行一次。试验方法防控措施一般规定本标准所有试剂和水在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682-2008中规定的三级水。检验结果的判定按GB/T8170中的4.3.3修约比较法进行。抽样按照GB/T1605-2001中“液体制剂采样”方法进行，用随机数表法确定抽样的包装件数，最终抽样量不少于200mL。有效活菌数与杂菌率的测定有效活菌数采用最大可能数计数法（MPN）测定；杂菌数采用平板菌落计数法测定，测出杂菌数（包括细菌和霉菌）后，再按照杂菌率的计算方式进行计算。试剂和溶液无菌水；D的规定；D的规定；杂菌数测定用培养基：细菌培养基按GB/T4789.28-2003中4.8规定，霉菌培养基遵照附录D的规定。试验仪器手持扩大镜（10倍）；V8漩涡混合器（转速范围：200～3000rpm/min，无级调速）；ECC-150A恒温培养箱[控温范围：RT+5～80℃，温度显示精度：0.1℃，控温精度：±0.1℃，控温均匀度：±0.5℃(37℃时)]；EOF-150A恒温烘箱[控温范围：RT+10～220℃，温度显示精度：0.1℃，控温精度：±1℃，控温均匀度：±1.5℃(150℃时)]；高压蒸汽消毒器；灭菌的培养皿：直径9cm；灭菌的螺口试管；灭菌的锥形瓶；灭菌的玻璃刮刀；灭菌的0.5mL、l.0mL、15mL吸管。菌株鉴别16SrDNA基因序列分析等手AB。16SrDNA基因序列分析进行菌种鉴别参C。有效活菌数的测定采用平板菌落计数法（A）或最大可能数法（MPN法）（B）测定有效活菌数量。平板菌落计数法灭菌培养皿301mL10mL2mL灭菌离心管10个、封口膜或保鲜膜。光合细菌双层平板培养基参见附录D。操作步骤:菌液稀释离心管中逐级稀释为10-110-210-310-410-510-610-710-810-910-10等十个浓度，分别做好标记。培养基的配置按要求分别配置上层和下层培养基，灭菌备用。倒下层培养基融化下层培养基，倒平板（约33mL/板）超净工作台中冷却待用。4）涂菌按无菌操作要求，用移液枪吸取100μL菌液到冷却凝固的下层培养基上，用涂布棒涂抹均匀。5）倒上层培养基融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，将其倒入已涂菌的下层培养基上,超净工作台中冷却至室温。用封口膜或保鲜膜将培养皿密封放置于30±1℃的恒温培养室，在2500lx～3000lx的白炽灯下光照培养7d～10d注：每个浓度重复三次。活菌数的计算方法选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。若三个稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落乘以稀释倍数。最大可能数（MPN）法试验仪器：10mL螺口试管20个、灭菌、试管架、移液枪10mL或5mL、1mL、灭菌枪头、超净工作台、封口膜或保鲜膜。光合细菌培养基配方：有效活菌数测定用培养基，配方参见附录D。操作步骤:选取10-8、10-9、10-10三个浓度梯度的稀释液做测定用。取20支装有9mL培养基的灭菌螺口试管，分别按3管一组标记为10-810-910-10CK1mL灭菌枪头按无菌操作要求吸取每个浓度梯度的稀释液各1mL放入对应编号的试管中，拧好试管盖。标记为CK的3支试管加入灭菌水1mL做对照。放置于30±1℃的恒温培养室，在2500lx～3000lx的白炽灯下光照培养7d～10d，统计每个浓度下三支试管整MPN见附录MPN数值，MPN值×107即为样品中有效活菌数浓度。杂菌率的测定细菌数的测定与计算方法细菌数的测定选取10-5、10-6、10-7三个浓度梯度的稀释液，用0.5mL无菌吸管吸取0.1mL，分别加至含有15mL营养肉汤培养基的培养皿(直径为9cm)表面，用无菌玻璃刮刀将稀释液均匀涂布，待菌液全部渗入培养36±1℃的恒温培养箱内倒置培养48±2h照。用肉眼计数菌落，必要时可借助手持放大倍数为10倍的扩大镜。细菌数的计算方法以平板上出现30～300个菌落数的稀释度平板为计数标准。当只有一个稀释度，其平均菌落数在30～300之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释度倍数。若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比例小于2应计数两者的平均数。若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数。若三个稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀稀度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。霉菌数的测定与计算方法霉菌数的测定10-510-610-70.5mL0.115mL马丁培养基的培养皿表面，用无菌玻璃刮刀将稀释液均匀涂布，待菌液全部渗入培养基后，放置于25℃～28℃的恒温培养箱内，d5d10倍的扩大镜。霉菌的计算方法通常选择菌落数在10～1502个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每毫升检样中所含的霉菌数。杂菌率的计算方法菌剂含杂菌率(X)按下式计算：式中：X——杂菌率，%；Z1——杂菌数(包括细菌和霉菌)，CFU/mL；Z2——有效菌数，CFU/mL。水不溶物质量分数的测定按GB/T28136-2011农药水不溶物测定方法测定。pH按GB/T1601的规定进行测定。悬浮率测定实验仪器量筒:250mL具塞量筒、100mL普通量筒；真空吸液器；秒表；三角瓶:250mL；恒温水浴锅。标准硬水配制方法按GB/T14825-2006中标准硬水配制方法进行。操作步骤5.00mL(0.01mL)250mL三角瓶中,100mL,50250mL具塞带刻度量筒中,250mL具塞带250mL30℃±25min,将量筒盖好,30次充分混匀，打开量筒塞子后重新将其放入恒温水浴锅中,30min225程中调整适当的真空度，吸液管嘴紧贴量筒管壁并保持在液面下3～5mm处跟随液面下降，勿搅动下部沉淀。量筒内余留的25mL悬浮液,按4.3.4进行有效活菌数的测定，此活菌数浓度记为C1。计算样品中的悬浮率(Y)按下列公式进行计算Y=(1-C1/C0)×1.1111×100式中:C0—步骤4.6.3中所取样品中的有效活菌数；C1—量筒底部余留的25mL悬浮液的有效活菌数；1.1111—换算系数允许差两次重复测定结果之差应不超过10%。倾倒性的测定按GB/T31737-2015进行。持久起泡性的测定按GB/T28137-2011进行。细度的测定按GB/T16150-1995中2.2进行测定，使用200目、孔径75μm的标准筛。稀释稳定性实验按HG/T2467.6-2003中4.9进行。静置1h后，如稀释液均一，无析出物为合格。低温稳定性实验实验仪器低温恒温培养箱：1～20±1℃；烧杯：100mL。实验方法取80mL试样置于100mL6±2℃保持1h，期间每隔15min搅拌115s，观察外观有无变化。将烧杯放回低温恒温箱中，6±2℃继续放置7d,将烧杯取出恢复至室温，测试有效活菌数应大于等于2.0×108亿CFU/mL，则符合标准要求判定为合格。热贮稳定性实验方法提要试样在45±2℃恒温环境下，密封保存14d，取出测试其有效活菌数。实验仪器或恒温水浴锅mL。实验步骤用注射器将约30mL试样，注入洁净的玻璃瓶中，置此玻璃瓶于冰盐浴中致冷，用塞子迅速封口。至少封3瓶，分别称量。将封好的玻璃瓶置于金属容器内，再将金属容器放入45±2℃恒温箱（或恒温水浴锅14d24h4.3检验规则符合GB/T1604有关规定。数值修约规则和极限值按GB/T8170处理。标志、标签、包装、贮运、安全和保证期标志、标签、包装、贮运GB3796GB3796中的有关规定。本产品应贮存于6～40安全保证期在规定的贮运条件下，从生产日期算起，保证期为1年。在保证期内，各项指标仍应符合表1的要求。附录A（规范性附录）沼泽红假单胞菌PSB-S沼泽红假单胞菌PSB-S来源：从湖南省蔬菜研究所田间采集的土样中分离、纯化获得。图A-1沼泽红假单胞菌扫描电镜0.8～1.0µm×2.4～3.1µm，端生鞭毛，以二分裂方式繁殖。生理生化结果：G－，V-P反应阴性，甲基红反应阴性，不能利用淀粉，H2S反应阴性；可以利（（丙NaHCO3883nm、808nm、593nm、382nmPH30～35℃、7～7.53%的特征。cs-1,0901cs-10901有显著的拮该菌株培养液对秀丽小杆线虫、根结线虫具有较强的作用活性，96h对秀丽小杆线虫和根结线虫的LC50分别为5.13mL/L和4.81mL/L。在温室盆栽条件下研究了该菌株培养液对番茄根结线虫病的防治效50倍稀释液处理药效可达71.5%，使黄瓜早期产量增加57.7%。各种试验均表明该菌株在植物线虫病害防治上有巨大应用潜力。附录B（规范性附录）菌种鉴别—生理生化特征法主要仪器设备和材料除常规微生物试验操作所需要的设备和培养条件，其他还包括：天平（感量0.0001）；生物显微镜（10×100倍）；高压灭菌锅；恒温培养箱；移液器；移液管；试管（15mL）及试管架；菌落计数器；匀质器；L形玻璃棒；培养皿（9cm）；载玻片；盖玻片；紫外分光光度计等。主要培养基和试剂培养基：光合细菌的双层培养基（附录D）形态学特征鉴别72~96h（非热固定菌体观察：用生物显微镜观察菌体形态，细胞直径、出芽分裂类型、玫瑰结形成等。菌落形态观察：在光合细菌双层培养基上生长72~96h，观察菌落的形态和产色素等。培养条件：本方法内，除暗室培养特殊要求，所有光合细菌培养均在光照1500lux，30℃条件下进行；固体培养采用双层平板法，液体培养采用250mL血清瓶加满培养基至瓶口厌氧培养。生理生化特征鉴别沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）及其近似种的生理生化特征检表特征沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）隐球红假单胞菌（Rhodopseudomonascryptolactis）朱丽亚红假单胞菌（Rhodopseudomonasjulia）Rhodopseudomonasrhenobacensis菌(Rhodoblastusacidoohilus）细胞直径(μm)0.6-0.91.01.0-1.50.4-0.61.0-1.3出芽分裂类型分裂管无柄无柄无柄无柄玫瑰结形成++++-运动能力+++++菌落颜色棕红-红色红色粉红红色红色-橙色-红色最佳pH6.96.8-7.26.0-6.55.55.5-6.0最佳温度30-3738-4025-352825-30硫酸盐同化+nd-++好氧黑暗生长能力+++++果糖发酵-ndndnd-光照培养利用H2硫代硫酸盐硫化物-硫化物硫ndH2生长因子p-ABA(b)B12np-ABA无p-ABA无化合物利用苯酸盐+柠檬酸盐+甲酸盐--++-葡萄糖--+--酒石酸盐+-Mol%G+C64.8-66.368.863.565.462.2-66.8主要醌类Q-10ndndQ-10Q-10,MK-10,RQ-10主要脂肪酸C14:0微量ndndnd0.8C16:05.2ndnd11.714.8C16:13.1ndnd9.537.2C18:07.3ndnd7.80.8C18:179.7ndnd66.146.0符号及缩写：+，阳性；-，阴性；b，生物素；n，尼克酰胺；t，硫胺素；p-ABA，对氨基苯甲酸；nd，未确定。pH用盐酸分别调节光合细菌培养基的pH值5.0~8.0，按每梯度为0.2配置梯度pH值培养液。采用250mL血清瓶液体光照培养将目标菌株培养72~96h后目测生长情况。最适温度25~40℃250mL血清瓶液体光照培养将目72~96h后目测生长情况。硫酸盐同化FeSO4250mL720.5mM/L的（NH4）2SO4相同250mL72~96h后目测生长情况。好氧黑暗生长能力在锥形瓶中加入入瓶体积25%的用光合细菌培养基，接入培养基5%体积的目标菌株菌液，封口膜（可通气）封口后，在180rmp条件下暗室震荡培养，72~96h后目测生长情况。果糖发酵配制基础培养基：1000mL蒸馏水中加入2.0g(NH4)2SO4、0.2gMgSO4·7H2O、0.5gNaH2PO4·H2O、0.1gCaCl2·2H2O、0.5gK2HPO4、2.0g琼脂。将1.0g果糖加入到基础培养基中配置成待测培养基。将目标菌株接种到待测培养基中，采用250mL血清瓶液体光照培养72~96h后目测生长情况。H2、硫代硫酸盐、硫化物、硫的利用H2利用方法测定：配制基础培养基，1000mL2.0g(NH4)2SO4、0.2gMgSO4·7H2O、0.5gNaH2PO4·H2O0.1gCaCl2·2H2O0.5gK2HPO4250mL500mL5mL/min，20mL/min72~96h后，观察菌株生长情况。0M0.2M3M、硫代硫酸钠(5mM)（0.5mM）250mL72~96h后目测生长情况。生长因子目标菌对生长因子需求测定方法，在光合细菌培养基中分别加入：b，生物素；n，尼克酰胺；t，0.1%72~96h后，观察菌株生长情况。有机碳源利用配制基础培养基：1000mL蒸馏水中加入2.0g(NH4)2SO4、0.2gMgSO4·7H2O、0.5gNaH2PO4·H2O、0.1gCaCl2·2H2O、0.5gK2HPO4、2.0g琼脂。将1.0g被测底物：苯酸钠、甲酸钠、酒石酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠分别加入到基础培养基中配置成待测培养基。将目标菌株接种到待测培养基中，采用250mL血清瓶液体光照培养72~96h后目测生长情况。醌类测定方法：取目标菌株培养液，4℃8500rmp离心取菌体50mg；冻干细胞并加入加20~40mL氯仿:甲醇（2:1,v/v）1~2h1mL氯仿:60F254:254nm1mLN2（或减压TLC测定与质谱分析（测定异戊烯单位数目及氢饱和度）等手段确定醌类化合物的类型。G+CmolDNADNA。DNA1%NanoDrop2000测定浓度，-20℃冰箱保存备用。Tm260nmDNA测0.1SSCOD2600.3~0.6260nm25℃然后温度3~5℃1℃ODOD值不变表示变性完毕。Tm值计算:（1）热变形温度测定完成后，将记录的温;2V与2℃VV25，求得相对的光密度值）G+Cmol%含量计算：0.1SSC：G+Cmol%=2.44Tm-69.31SSC：G+Cmol%=2.08Tm-106.4注：必须以大肠埃希氏菌（E.coliK12）为参比操作对照，以核实实验误差。主要脂肪酸的测定250mL96h8500rmp4℃4mL的甲醇/CH2Cl230℃10min（1800rpm，10min），收集上清液，重复3次；将萃取液在柔和氮气流下吹干。向挥发完萃取液的离心管中加入3mL6KOH（gKOH/mL左右10min30min3次，室温放置过夜（瓶盖盖紧2mL10min3（水相）1mL4NpH<2，再2mL32mLBF3-MeOH，90℃2h5%NaCl1mL，2mL32mL进样瓶中，氮气吹干，待分析。脂肪酸的测定采用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）分析。T/SPPHN005-2024附录T/SPPHN005-2024附录C（规范性附录）PAGEPAGE13菌种鉴别方法—16SrDNA基因序列分析法DNA7～10dDNA提取试剂DNADNA1%NanoDrop2000测定浓度，-20℃冰箱保存备用。引物设计16SrDNA序列通用引物：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1429R:5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。16SrDNAPCRDNAPCR50μLPCR扩增。PCR扩增体μL10PCRbuffer20mmol/LMgCl24μL1μLPrimerF(上游引物μLPrimer下游引物），0.3μLDNA聚合酶，2μLDNAddH2O50μL。PCR10min95℃45℃1453572℃10扩增产物用1%PCR3DNA设立阴性对照管。PCR1%16SrDNA16SrDNANCBIBLAST程序对比，通NCBI99%相近序列进而确定菌种。T/SPPHN005-2024T/SPPHN005-2024PAGEPAGE14附录D（规范性附录）光合细菌培养基醋酸钠0.5gYeastextract1.5K2HPO41gKH2PO40.6g（NH4）2SO40.5gFeSO4·7H2O0.05gH3BO4 0.05g加蒸馏水至 1L 琼脂1.3g（下层）,1.8g（上层）[若配双层固体培养基]注：根据实际情况将PH值调到7时的用量为准（K2HPO4）有效活菌数测定的选择性培养基乙酸钠1.64gMgSO4·7H2O 0