T-SPPHN 003-2024 豆科蔬菜主要病毒病综合防控技术规程

ICS01.040.65CCSB15/19CodeofIntegralPreventionTechnologyoftheEpidemicLegumeVegetable湖南省植物保护学会发布I本文件是根据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由湖南省植物保护学会提出。本文件由湖南省植物保护学会归口。本文件起草单位为湖南省农业科学院、宁波大学、全国农业技术推广服务中心、沈阳农业大学、中国农业科学院植物保护研究所、江苏省农业科学院植物保护研究所、广东省农业科学院、云南农业大学、山东省农业科学院。本文件主要起草人：刘勇、燕飞、张松柏、章东方、张卓、史晓斌、张德咏、孙书娥、严丹侃、郑红英、顾江涛、张海珊、张安盛、季英华、吴元华、李方方、何自福、刘慧、李凡。1豆科蔬菜主要病毒病绿色综合防控技术规程本标准规定了豆科蔬菜主要病毒病的术语和定义、发生流行规律、病害诊断、防治原则、防治方法、加强病虫测报，实行统防统治、建立防治档案等技术要求。本标准适用于豇豆、蚕豆、菜豆和豌豆等豆科蔬菜主要病毒病的综合防控。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4285农药安全使用标准GB/T8321农药合理使用准则3术语和定义GB/T35333和界定的以及下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本标准。3.1综合防控技术IntegratedPreventionandControlTechnology综合防控是基于“预防为主、综合防治”的植保方针，以确保农业生产、农产品质量和农业生态环境安全为目标，以减少农药使用为目的，优先采取生态调控、生物防治、物理防治和科学用药等资源节约型、环境友好型技术来控制农作物病虫害的植物保护措施。3.2豆科蔬菜LegumeVegetables豆科蔬菜主要包括豇豆、蚕豆、菜豆和豌豆等蔬菜。3.3病毒病VirusDisease即由植物病毒侵染引起的病害，具有寄生性、专一性或广谱性等特性。3.4鉴别寄主DifferentialHost对特定病原物有特殊反应或表现特定症状的植物称为鉴别寄主。3.5阳性对照PositiveControl2凡是确定可以出现预期结果的处理，称为阳性对照。3.6阴性对照NegativeControl凡是确定不会出现预期结果的处理，称为阴性对照。3.7空白对照BlankControl凡是不加处理因素的处理，称为空白对照。4发生流行规律豆科蔬菜病毒病主要由黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）、蚕豆萎蔫病毒（Broadbeanwiltvirus，BBWV）、紫云英矮缩病毒（Milkvetchdvirus，MDV）等病毒引起。常表现为多种病毒的混合侵染。CMV、TMV和BBWV均可由蚜虫或汁液接触传播，而MDV主要由蚜虫以持久方式进行传播。病毒可在多种植物上越冬，病残体、带毒种子均可成为病毒病的初侵染源。通过有翅蚜虫迁飞传播扩散蔓延，全年均可发病，以春秋季发病最为严重。整枝，打叉，搭架，采果等农事活动中，只要造成寄主微创口，即可侵入危害。此外，土壤瘠薄、黏重、板结、排水不良和偏施氮肥都会加重病情发展。5病害诊断5.1病害田间诊断豆科植物感染病毒后，症状表型多样，主要有花叶斑驳、明脉皱缩、矮化等类型症状。症状类型参见附录A。5.2生物学检测具体方法和检测结果见附录B。5.3血清学检测具体方法和检测结果见附录B。5.4分子生物学检测具体方法和检测结果见附录B。6防治原则根据豆科蔬菜病毒病和传毒害虫的发生规律及危害特点，本着“预防为主，综合防治”的指导思想，从农田生态系统整体出发，保护生物多样性，控制生产环境，减少病毒来源，优先选择农业防治、物理防治、生物防治技术，尽量减少化学农药的使用。7防治方法37.1农业防治7.1.1种植抗病品种根据各地栽培条件选用抗病品种。7.1.2留种设立无病留种田，在留种田淘汰病株，减少毒源，从无病优质的良种株上采集种子。7.1.3种子消毒播种前将种子在清水中浸泡（蚕豆浸泡2~3d，豌豆1d，菜豆3~4h，豇豆不能浸种），再放入10%磷酸三钠溶液中浸种20～30min，捞出后用清水冲洗干净后播种；选用30%噻虫嗪拌种；或者选用商品包衣种子。7.1.4合理轮作尽量避免与豆科作物重茬栽培，选用空茬地或倒茬地，与非豆科作物合理轮作。7.1.5田间卫生清除田间及周边杂草，加强肥水管理，及时摘除病叶，拔除病株。7.2物理防治7.2.1使用防虫网大棚豆科蔬菜选择60目以上的防虫网。7.2.2色板诱杀对于矮杆豆科作物（豌豆、蚕豆等）可采用色板诱杀蚜虫，在田间放置30cm×40cm的诱虫黄板300~450块/hm2，呈棋盘式均匀插置田间，黄板底部略高出植株顶端10~20cm左右，黄板粘满害虫后及时更换。7.3药剂防治药剂使用应符合GB4285和GB8321的相关规定。7.3.1病毒病防治病毒病防控以预防为主，当病情指数≥5%时，选择使用高效、低毒、低残留农药进行防治。由于豆科蔬菜，尤其是大棚内种植，采收之前7~10d，必须停止用药。防治病毒病常用药剂的用量及用法见附录C。7.3.2蚜虫防治抓好早治蚜连续治蚜，减少虫媒传毒。当蚜株率≥5%时，优先采用植物源农药，严禁使用禁用农药或高毒农药，防治蚜虫常用药剂的用量及用法见附录C。8加强病虫测报，实行统防统治4根据田间调查情况结合气象因素分析，及时对病虫害进行预测预报，当病虫害达到影响经济阀值时，当地政府应组织种植户对整片作物进行科学的病虫害防治。9建立防治档案在田间调查豆科病毒病发生情况时，具体调查内容参见附录D。5附录A（资料性附录）豆科蔬菜病毒病症状豇豆病毒病主要表现为花叶、明脉、矮缩等症状。以花叶症状最为常见，叶片受害后，在新叶上表现黄绿相间的花斑或不规则花叶；明脉型主要表现在叶片上，嫩叶初呈明脉、失绿或皱缩；矮缩型表现为叶片皱缩、卷叶，叶色浓绿，腋芽簇生，基本不能开花结实，严重矮化，甚至整株死亡（图A1）。图A1豇豆病毒病症状蚕豆感病后表现褪绿花叶，叶片皱缩，叶脉黄化，植物矮小，少花，不结实或结实率低。生长后期感病后，顶部叶片稍显花叶，基部叶片正常；严重的顶部叶片向上合拢，呈现花叶、皱缩、卷曲症状（图A2）。图图A4豌豆病毒病症状图A2蚕豆病毒病症状菜豆感病后，表现花叶，叶片出现明脉、产生褪绿带、斑驳或绿色部分凹凸不平，叶片皱缩、扭曲、畸形，株形矮小，开花迟缓或落花，开花结荚明显减少，豆荚短小（图A3）。图A3菜豆病毒病症状豌豆感病后常表现叶脉半透明、花叶、叶皱、小叶下卷、苗卷曲、早枯、节间缩短、株矮、结荚少或不结荚等症状（图A4）。图A4豌豆病毒病症状7（规范性附录）豆科蔬菜病毒病生物学、血清学检测B.1病毒生物学检测B.1.1病毒摩擦接种方法将少许感染病毒的病叶，放于研钵，加入适量接种缓冲液，充分研磨。用喷粉器将金刚砂（200~400目）撒到待接种叶的表面（也可直接将金刚砂加在研磨液中在营养钵内插上标签，注明处理及时间；用手指或研棒蘸取少许汁液，在待接种叶面上轻轻均匀地涂擦，沿一个方向抹，一般沿叶基到叶尖方向，涂擦时用另一只手指托住叶片，注意用手涂擦前需用肥皂洗净手指；用清水冲洗接过种的叶片，将植株放于温室（最好22~25℃)。用缓冲液接种植株作对照；将带毒叶片用接种缓冲液研磨后采用摩擦汁液接种的方法接种于枯斑寄主上，待枯斑寄主表现单斑后，将单个斑点剪下，用接种缓冲液研磨再次接种至枯斑寄主，出现单斑症状后再次取下单斑接种于枯斑寄主，出现斑点后再取单个斑点接种于系统寄主，出现系统症状后再取叶片进行保存和检测。B.1.2病毒的保存与测定将经过三次单斑纯化后的毒源，再次接种至系统寄主上，待其出现系统症状后，取发病叶片冷冻干燥处理后，写明标签，存于-80℃冰箱。将经分离纯化后得到的不同病毒的病毒分离物分别接种至病毒敏感植物上，观察其症状（见图B1、图B2、图B3）。图B1CMV分离物接种至克氏烟上的症状：系统花叶。8图B2TMV分离物接种至本氏烟上的症状：系统花叶，皱缩卷曲。图B3BBWV分离物接种至普通烟上的症状：枯斑。B.2病毒的血清检测植物叶片称重后，按重量体积比1:10~1:50（g/ml）加入0.01mol/LPBS研磨；8000rpm离心3min；取100μL上清点入已包被抗体的酶标板中，室温孵育2h；吸出样本上清液，每孔点入300μLPBST，清洗（4~5次）；吸干酶标孔中PBST，点入100μL的碱性磷酸酶标记的二抗，室温孵育2h；吸出样本上清液，每孔点入300μLPBST，清洗（7~8次）；吸干酶标孔中PBST点入300μL1mg/ml的显色底物PNPP，避光反应30min，待阳性对照显色明显后，使用酶标仪OD450nm读数，为阴性对照读数2倍以上的为阳性，2倍以下的为阴性，见图B4。9图B4TMV、CMV和BBWV分离物的DAS-ELISA检测结果B.3分子生物学检测B.3.1模板RNA的制备采用硅粒吸附法提取植物总RNA。取病叶0.1g，加1mLGB溶液，研磨至匀浆；取500μL研磨液，加100μLNLS，70℃温育10min，不时上下颠倒混匀，冰上放置5min，13000rpm离心10min；取300μL上清，加150μL无水乙醇，300μLNaI，25μL硅溶液，混匀，室温下不停颠倒混匀10min；6000rpm离心1min，倒去上清；加500μL洗涤液（WB:无水乙醇=1:1）洗涤，6000rpm离心1min，倒掉上清，重复该步骤；沉淀加ddH2O150μL，70℃温育4min，1min后将离心管盖打开，随即盖上；13000rpm离心3min，取上清100μL，-20℃保存。由于MDV为DNA病毒，需进行DNA提取。每份样品选取10g叶片，将叶片置于液氮中，充分研磨后，按植物基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取DNA，加入BufferLP1和RNaseA，振荡裂解，加入BufferLP2，12000rpm离心5min，取上清液，加入BufferLP3。加入吸附柱中，12000rpm离心1min。弃掉废液，向收集管中加入BufferGW，12000rpm离心1min，重复1次。将吸附柱放入新离心管中，滴加100μLBufferGE，静置5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存备用。B.3.2RT-PCR扩增（1）反转录以硅粒吸附法提取的总RNA为模板，选取随机引物进行反转录，反转录合成cDNA，具体反应体系及步骤见表B1。表B1病毒反转录体系试剂体积TotalRNARandomPrimer2×TSReactionMixRIEnzymeMixgDNARemover总体积20μL上述混合液25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加热5min，-20℃保存。（2）反应引物TMV、BBWV、CMV、MDV的特异性引物见表B2。表B2TMV、BBWV、CMV、MDV的特异性引物病毒名称（前引/后引）引物序列片段长度ATTTAAGTGGASGGAAAAV(W=A或T；M=A/C；S=G/C,V=G/A)（3）反应体系TMV、BBWV、CMV特异性RT-PCR和MDV的PCR反应体系见表B3表B3TMV、BBWV、CMV特异性RT-PCR和MDV的PCR反应体系试剂体积10×Buffer2.0μL2.5mMdNTP酶0.3μLcDNA加水定容至20μL（4）反应程序TMV、BBWV、CMV特异性RT-PCR反应程序和MDV的PCR反应程序见表B4表B4TMV、BBWV、CMV特异性RT-PCR反应程序和MDV的PCR反应程序病毒名称反应程序TMV94℃预变性4min，94℃,45s；55℃,45s；72℃,1min，35个循环；72℃延伸7min。BBWV94℃预变性4min，94℃,45s；56℃,45s；72℃,1min30s，35个循环7min。CMVMDV94℃预变性4min，94℃,45s；55℃,45s；72℃,1min，35个循环；72℃延伸7min。B.3.3琼脂糖凝胶电泳1%琼脂糖凝胶电泳检测，取5µL扩增反应物与2µLSYBRGreenӀ染料、3µLloadingbuffer混匀，点入样孔内。电泳缓冲液1×TAE适量，100V，电泳30min。B.3.4目的片段的克隆与分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，使用Alpha凝胶成像系统观察并拍照记录。扩增片段与预期目标条带大小一致，则为阳性样品，表明植物叶片中携带该病毒，结果见图B5、图B6、图B7和图B8。图B5豆科作物携带BBWV的检测图B6豆科作物携带CMV的检测图B7豆科作物携带TMV的检测图B8豆科作物携带MDV的检测B.4病毒分子生物学检测所用试剂如下：（1）GB溶液4.0M异硫氰酸胍0.2MNaAc(pH5.2)25mMEDTA(pH8.0)2.5%(W/V)PVP-40（2）10%NLS将1g月桂酰醇（NLS）溶于10mL水中即得10%NLS溶液。（3）WB溶液1mMEDTA(pH8.0)20mMTris-HCl(pH7.5)10mMNaCl（4）NaI溶液6MNaI0.15MNa2SO3（5）硅溶液将60g二氧化硅溶于500mL水中，静置24h，