T-SHAAV 016-2024 猫呼吸道病原检测 微流控芯片法

ICS11.220B41SHAAV团体标准T/SHAAV016—2024猫呼吸道病原检测微流控芯片法MicrofluidiCChipmethodforfelineupperrespiratorytractdiseasepathogens2024-04-10发布2024-04-10实施上海市畜牧兽医学会发布T/SHAAV0162024前言 II1范围 2规范性引用文件 l3术语和定义 4缩略语 5原理 26试剂和材料 7仪器设备 8样品采集、保存、运输和处理 9操作步骤 10质量控制 附录A(规范性)试剂配制 附录B(资料性)引物序列 附录C(资料性)微流控芯片的制作 附录D(规范性)核酸提取 lT/SHAAV0162024前言本文件按照GB/T1.12020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市畜牧兽医学会提出并归口。本文件起草单位:上海市动物疫病预防控制中心、复旦大学、上海市崇明区动物疫病预防控制中心、上海市金山区动物疫病预防控制中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、上海速芯生物科技有限公司、宁波爱基因科技有限公司。本文件主要起草人:杨德全、鞠厚斌、王建、方雪恩、李鑫、沈海潇、杨显超、赵洪进、陈琦、盛文伟、苑建军、卢春光、翁永刚、葛菲菲、李健、王晓旭、孔继烈、李杨、刘萌、张强、吴秀娟、李凯航、周锦萍、唐燕婷、陶田谷晟、唐聪圣。本文件首批承诺执行单位名单:上海市动物疫病预防控制中心、复旦大学、上海市崇明区动物疫病预防控制中心、上海市金山区动物疫病预防控制中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、上海速芯生物科技有限公司、宁波爱基因科技有限公司。llT/SHAAV0162024猫呼吸道病原检测微流控芯片法本文件规定了猫呼吸道病原微流控芯片检测的原理、试剂和材料、仪器设备、样品采集、保存、运输和处理、操作步骤、质量控制和结果判定。本文件适用于猫流感病毒、猫嵌杯病毒、猫疱疹病毒1型、衣原体、支原体和支气管败血波氏杆菌六种呼吸道病原核酸的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBT6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NYT541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。微流控芯片microfluidicchip以硅、玻璃、金属材料、高分子聚合物等材料为芯片基材,利用微纳加工、精密注塑等加工技术加工而成,其中包括一个或多个微管道、微阀、微反应池等功能单元,能够完成芯片内液体流动的精准操控,从而实现某种特定生化反应功能的生物芯片。[来源:GBiT415212022,3.1]3.2环介导等温扩增loop-mediatedisothermalamplification,LAMP在BstDNA聚合酶作用下,以DNA为模板,以特异性引物为延伸起点,在60℃~65℃恒温条件下通过链置换反应进行的DNA扩增方法,扩增产物是一系列复杂的大小不等的DNA混合物。是一种区别于PCR等变温扩增反应的等温核酸扩增方法。[来源:SNT3767.12014,3.1.5]4缩略语下列缩略语适用于本文件。Bst:嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearthermophilus)DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate)DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)LAMP:环介导恒温扩增(LooP-mediatedisothermalamplification)PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(Ribonucleicacid)Tt:时间阈值(Timethreshold)T/SHAAV01620245原理基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。针对靶序列的6个区域设计4条特异引物(包括2条内引物和2条外引物),利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA,其反应过程包括铃状状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段,最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物。通常为了提高反应效率,还在反应体系中添加两条环引物,使之分别与茎环结构结合,启动链置换合成,循环复制。在微流控芯片上,利用荧光染料掺入法在微流控芯片核酸恒温扩增仪上进行恒温反应和实时荧光分析,在具有链置换功能的聚合酶作用下,扩增阳性的样品会产生类似"S"形扩增曲线一步完成对靶基因的扩增和检测。6试剂和材料6.1试剂配制6.1.1除另有规定,所用化学试剂均为分析纯,试验用水符合GB/T6682规定的二级水,所有试剂均用无RNA酶的容器分装。6.1.2异丙醇:20ec预冷。6.1.3氯仿:2C8保存。6.1.4TRIzol:2C~8C保存。6.1.5DNAzol:2C~8ec保存。6.1.6DEPC水:配制方法按附录A中的A.1。6.1.775%乙醇:用无水乙醇和DEPC水配制,-20C预冷。6.1.88mmoLNaoH溶液:配制方法按A.2。6.1.90.01mol/LPBS(PH7.4):配制方法按A.3。6.1.1O50%甘油磷酸缓冲液(PH7.4):配制方法按A.4。6.1.11商品化荧光等温扩增预混液:含反转录酶、BstDNA聚合酶和荧光染料等。6.2材料6.2.1微流控芯片:制作微流控芯片所用猫呼吸道病原的LAMP扩增引物见附录B,其制作方法按附录C。也可根据实际需求选择其他类型的等效商品化的微流控芯片。6.2.2芯片封口膜。7仪器设备7.1II级生物安全柜。7.2微流控芯片核酸恒温扩增仪。7.3微量点样仪。7.4恒温干燥箱。7.5高速冷冻离心机,可控温至4℃,离心速度可达12000rmin以上。7.6涡旋振荡仪。7.7微量移液器,量程为0.5UL~10L、2UL~20UL、20UL200UL和200UL~1000UL。2T/SHAAV01620247.8冰箱,储藏温度在2C8ec、-20C以下和-70C以下。8样品采集、保存、运输和处理样品采集宜在发病初期、选择具有典型临床症状的猫进行,采样过程中应避免交叉污染,样品采集、保存、运输和处理应符合GB19489和NYT541的要求。8.2样品采集8.2.1组织样品采集用无菌剪刀、镊子分别采集约2cmx2cm大小的病死猫肺脏、肝脏、脾脏和胰腺等以上器官有病变和正常组织交接处的组织,置于无菌离心管中并编号。8.2.2眼分泌物拭子样品采集用无菌采样拭子轻轻搔刮双侧眼结膜取分泌物(来回滑动3次),置于装有1mL50%甘油磷酸盐缓冲液的样品保存管中并编号。8.2.3鼻咽拭子样品采集把拭子浸润到生理盐水中,然后通过鼻腔缓慢的插入到鼻咽部位,在受到阻力以后停留数秒,轻轻旋转,将拭子取出置于装有1mL50%甘油磷酸盐缓冲液的样品保存管中并编号。8.3样品保存与运输采集的样品应放入主容器密封后,采用保温箱加冰袋或干冰密封,应在8h之内送到实验室。上述采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品,在2℃~8℃下保存不超过24h,-70℃以下长期保存。8.4样品处理8.4.1组织样品处理取适量组织样品置于组织匀浆器或研磨器中充分研磨,加入PBS制备成10%组织匀浆液。10000rmin,4oc离心10min,取上清,转入1.5mL灭菌离心管中,用于核酸检测。8.4.2眼分泌物拭子和鼻咽拭子样品将眼分泌物拭子或鼻咽拭子样品在振荡器上充分混合后,将拭子中的液体挤出后弃去拭子。3000rhmin,4℃离心5min,取上清液,转入1.5mL灭菌离心管中,用于核酸检测。9操作步骤9.1样品RNA提取TRIzol法抽提核酸,按照附录D中D.1的方法。也可采用等效RNA提取试剂或方法,如采用自动化核酸提取仪和配套核酸提取试剂进行核酸提取。9.2样品DNA提取DNAzol法抽提核酸,按照附录D中D.2的方法。也可采用等效DNA提取试剂或方法,如采用自动化核酸提取仪和配套核酸提取试剂进行核酸提取。9.3扩增试剂的准备与配制9.3.1从-20C±5oc取出试剂,将各试剂于室温下解冻,充分混匀并瞬时离心后备用。9.3.2每个加样孔进样体积为25UL,按表1配制25μL反应体系。3T/SHAAV0162024表1反应体系表组分名称体积荧光等温扩增预混液检测样品核酸模板15总反应体系25注:引物等己经预先固定到微流控芯片上,最终微流控芯片中的反应体系包含反应所需的引物。94加样将上述反应体系旋涡振荡混匀瞬时离心全部加入到微流控芯片加样孔中用与芯片匹配的封口膜封住加样孔(参见附录C)及透气孔使用刮片赶走气泡确保封口膜完全贴合95检测将上述封装好的芯片的凹处对准微流控芯片检测仪卡扣的凸处水平按下即可按以下程序设置:1600r/min低速离心10S4600r/min高速离心30S温度为635℃反应时间为30min检测完成后仪器自动进行数据分析10质量控制101检测过程中分别设阴性对照阳性对照空白对照和内参对照102阴性对照为DEPC水103阳性对照为含猫呼吸道病原靶基因序列的重组质粒104空白对照为存在于微流控芯片反应孔中不含有任何引物105内参对照为含细胞色素C氧化酶亚基1序列的重组质粒其引物包埋于微流控芯片反应孔中11结果判定111试验成立的条件1111空白对照:反应时间30min内无荧光信号检出未出现典型扩增曲线1112阴性对照:反应时间30min内无荧光信号检出未出现典型扩增曲线1113阳性对照:反应时间30mi内有荧光信号检出且出现典型扩增曲线Tt值<301114内参对照:反应时间30min内有荧光信号检出且出现典型扩增曲线Tt值<301115同时满足以上条件此次试验视为有效则可以判读各病原的检测结果112结果描述及判定反应时间30min内无荧光信号检出未出现典型扩增曲线时判定为阴性表示样品中无该病原体核酸反应时间30min内有荧光信号检出且出现典型扩增曲线Tt值<30时判定为阳性表示样品中有该病原体核酸4T/SHAAV0162024附录A(规范性)试剂配制A.1DEPC水将DEPC加入去离子水中至终浓度为0.1%(体积比),充分混合均匀后作用12h,分装,103kpa高压蒸汽灭菌30min,4c保存备用。A.28mmolLNaoH溶液称量0.32gNaoH,去离子水溶解后定容至1000mL,室温保存。A.30.01mol/LPBS(PH7.4)称取8.0g氯化钠(Nacl)、0.20g氯化钾(kcl)、1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)、0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4),加蒸馏水溶解,调整PH至7.4,定容至1000mL,103kpa高压蒸汽灭菌30min,或过滤除菌,4℃保存备用。A.450%甘油磷酸缓冲液(PH7.4)将0.01molLPBS与纯甘油(分析纯)等量混合,调整PH至7.4,分装为小瓶,103kpa高压蒸汽灭菌30min,4℃保存备用。5T/SHAAV0162024(资料性)引物序列B.1猫呼吸道病原LAMP扩增引物见表B.1.表B.1猫呼吸道病原LAMP扩增引物序列病原名称引物名称目的基因序列(5'-3')猫流感病毒IV-F3PB2GTAAACAGAGCAAACCAAAGAIV-B3TCAGTGCTGGAATATTCATCTIV-FIPTTCAATCCCCCAATTCTGAAACAGT-ATGCATCAACTCCTGAGACIV-BIPAATGTYATGGGAATGATCGGAATAT-CCATTTTACTAACTCTTAYTCCTCT猫嵌杯病毒FCV-F3ORF1GACAATGTCTCAAACTCTGAGCFCV-B3CGATCCATCATCGGGGATGFCV-FIPCGCCTCCGAGCAAGTGTTAACT-TTCGTGCTTAAAACTCACAACGFCV-BIPGTGCGGAGGCTTGTCCTTCT-TCGGTAGATGTGCAGTTAGGFCV-LFAGTGCACAAAGTCCTTACGGA猫疱疹病FHV1-F3TKTCTCTGGTCTGTTTCCCAFHV1-B3GCGTGAATTAGCTTCATGTCFHV1-FIPGGAAGTGTTGCCATTAGACTAAGTTCGCAAGATATTTTGTGGGTFHV1-BIPCCTCCTGGTGGAAATCTAGTTGTAA-GTTCTCCGGTTCTTGAGCFHV1-LBGAATATCGAGGAACATTTGAAGCGT衣原体chl-F3ompATTTTCTGCACGCTAGGAGchl-B3CATTCCCACAAAGCTCCGchlFIPGCAAGACCAATCAATCCGACA-CTAATGGTTACTTCAAAGCAAGTchl-BIPAGGAACTGATTTCGCCAATCAG-AGAAAATGCGGTATCTGTGT支原体MYco-F316SrRNAATTAGCGAGACACGTTGTMYco-B3AGTTTCACCTTCTGTGCTMYco-FIPCGCCGCTACTGATGGAATCATTA-GAACTGAAACATCTTAGTAGCAAMYco-BIPCCAAACCAACTTAGTTGGGGT-AGTTTTCCAACTTATTCTGCT支气管败血波氏杆菌Bb-F3DNT1GTTCGCCAGCTACGCGBb-B3CGATGTCAGCACCTTGTAGTBb-FIPCCGCTGCGCCTCGAGTATGC-GAGTATGCGGCCCAGTTCBb-BIPCGGATTCTGGCCCTGGGCTTTCTGCAGGGGAAGGCACBb-LBGCGGATGACGGTCGATCAT/SHAAV0162024(资料性)微流控芯片的制作C.1引物工作液的配制将附录B中各引物配制成浓度为100ymol/L的储存液,分别吸取引物F3、B3、FIP、BIP、LF(LB)储存液各10UL、10UL、80L、80L、10YL于离心管中混合,再加入0.89mLDEPC水,涡旋混匀,500rlmin离心30S,即作为引物工作液。C.2引物包埋采用微量点样仪,将各个引物均匀的点布在微流控芯片上的特定位置区域,每反应孔添加引物工作液2UL,芯片反应孔和加样孔的布局示意图如图C.1.将加好引物工作液的芯片置于37c恒温干燥箱干燥30min,确保彻底干燥后贴上封口膜密封芯片。图C.1猫呼吸道病原联检微流控芯片布局示意图说明:A1、Bl猫流感病毒检测孔;C1猫流感病毒阳性对照孔;D1猫流感病毒阴性对照孔;A2、B2猫嵌杯病毒检测孔;C2猫嵌杯病毒阳性对照孔;D2猫嵌杯病毒阴性对照孔;A3、B3猫疱疹病毒1型检测孔;C3猫疱疹病毒1型阳性对照孔;D3猫疱疹病毒1型阴性对照孔;A4、B4衣原休检测孔;C4衣原休阳性对照孔;D4衣原休阴性对照孔;A5、B5支原体检测孔;C5支原体阳性对照孔;D5支原体阴性对照孔;A6、B6支气管败血波氏杆菌检测孔;C6支气管败血波氏杆菌阳性对照孔;D6支气管败血波氏杆菌阴性对照孔;A7、B7、C7、D7空白对照孔;A8、B8、C8、D8内参对照孔。7T/SHAAV0162024(规范性)核酸提取D.1样品RNA提取D.1.1待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示,取n个灭菌1.5mL离心管,逐管编号。D.1.2每管加入600YLTRIzol.D.1.3每管对应编号分别加入200μL待检样品、阳性对照和阴性对照,混匀。D.1.4每管加入200UL氯仿,充分颠倒混匀。于4C、12000rimin离心15min。D.1.5新取n个灭菌的1.5mL离心管,逐管编号,每管加入500μL异丙醇(-20c预冷)。D.1.6吸取D.1.4各管中的上清液500μL,转移至D.1.5相应的离心管中,避免吸出中间层,颠倒混匀。D.1.7于4C、12000r'min离心15min,轻轻倒去上清,倒置