多糖结构构象及生物活性概述

天然产物活性多糖的结构与构象及生物活性的研究组员：李冰，刘晨，史蕊，薛冰，朱传胜1

多糖的结构的概述1·1结构层次

多糖的结构分类沿用了蛋白质和核酸的分析方法。单糖是糖类的组成单元,单糖之间脱水形成糖苷键,并以糖苷键线性或分支连接成寡糖和多糖。一般将少于20个糖基的糖链称为寡糖,多于20个糖基的糖链称为多糖。寡糖和多糖的结构也可分为一级、二级、三级、四级结构。1·1·1一级结构

多糖的一级结构是指糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头碳构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等。糖的一级结构非常复杂,再加上糖残基上可以连接硫酸基团、乙酯基团、磷酸基团、甲基化基团,这就更加剧了糖一级结构的复杂性。多糖的一级结构同多糖杂多糖直链淀粉的一级结构支链淀粉的一级结构1·1·2二级结构

多糖的二级结构指多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体,只关系到多糖分子中主链的构象,不涉及侧链的空间排布。在多糖链中,糖环的几何形状几乎是硬性的,各个单糖残基绕糖苷键旋转而相对定位,可决定多糖的整体构象。通常糖苷键有两个可旋转的主链二面角:φ(H1-C1-O1-C糖配基),ψ(C1-O1-C糖配基-H糖配基),两个单糖若为1→6连接,则还有第三个可旋转的二面角ω(O6-C6-C5-O5),解决寡糖构象的关键在于确定φ、ψ、ω的取值。但是,它们的取值受相邻糖环之间的空间阻碍和相邻糖残基间的非共价键相互作用的严格限制。因此,多糖的二级结构形式主要依赖一级结构的排步。直链淀粉的二级结构1·1·3三级和四级结构 多糖链一级结构的重复顺序,由于糖单位的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非共价相互作用,导致有序的二级结构空间有规则而粗大的构象,即是多糖链的三级结构。多糖的四级结构是指多聚链间非共价键结合形成的聚集体。

2多糖结构的研究趋势

近20年来,许多糖类物质不断进入临床研究,主要集中在抗感染、抗肿瘤、抗风湿、抗消化道溃疡和增进免疫功能等方面实验与应用。但由于多糖本身的结构复杂,很多特殊的生物活性都与其复杂的空间结构关系密切,因此对多糖结构的研究是开发新一代糖类药物的关键。目前,国内外对多糖结构的研究主要有两个趋势:

一是在多糖常规结构分析方法基础上,引入免疫生物化学、PCR等现代分子生物学技术,进行多糖化学结构与活性的系统研究;

二是借助最新的仪器与计算机模拟技术,研究和模拟多糖在溶液中的构象变化,以研究糖类物质在参与生命活动、产生生物效应时的精细结构。3多糖结构的分析方法

与其它生物大分子一样，糖链的二级以上高级结构是以一级结构为基础的。不同的是，与蛋白质或核酸大分子相比，糖链的一级结构“含义”要丰富得多。测定糖链的一级结构，要解决以下几个问题：（1）相对分子质量；

（2）糖链的糖基组成，各种单糖组成的摩尔比；

（3）有无糖醛酸及具体的糖醛酸类型和比例；

（4）各单糖残基的D-或L-构型，吡喃环或呋喃环形式；

（5）各个单糖残基之间的连接顺序；（6）每个糖苷键所取的α-或β-异头异构形式；

（7）每个糖残基上羟基被取代情况；

（8）糖链和非糖部分连接情况；

（9）主链和支链连接位点；

（10）糖残基可能连接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基的类型等。

多糖结构的分析手段很多，不仅有仪器分析法，如红外、核磁共振、质谱等，还有化学方法，如部分酸水解、完全酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等，以及生物学方法，如特异性糖苷酶酶切、免疫学方法等（见表1）

表1多糖的结构分析方法

多糖的相对分子质量可以用量均相对分子质量（Mw）、数均相对分子质量（Mn）、重均相对分子质量（Mw）和粘均相对分子质量（Mv）表示。

目前测定多糖相对分子质量的方法主要有渗透压法、蒸汽压法、端基法、光散射法、黏度法、超过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、凝胶过滤法和HPGPC（高效凝胶渗透色谱法）等。HPGPC测定多糖相对分子质量具有快速、高分辨率和重现性好等优点，在国内外得到广泛使用。3·1相对分子质量的测定3·2化学降解分析方法3·2·1单糖组成测定

多糖水解后生成的单糖混合物或单糖甲基糖苷混合物可以用TLC（薄层色谱法）、HPLC（高效液相色谱法）或GC（气相色谱法）等方法作定性鉴定和定量分析。GC分析时，待测样品要转换成易挥发、热稳定性好的衍生物，如糖三甲基硅醚、糖醇乙酸酯、糖三氟乙酸酯等。样品的水解方法有甲醇水解、盐酸水解、硫酸水解和三氟乙酸水解等，其中三氟乙酸水解法最为常用。3·2·2部分酸水解

通过部分酸水解的方法将多糖水解成易于分析的小片段。一般来说，吡喃型糖基比呋喃型糖基稳定，己糖比戊糖稳定，1-6糖苷键对酸水解相对稳定，主链的糖基比支链的糖基稳定。因此，通过部分酸水解可以判断糖苷键的断裂次序，推断可能的糖苷键类型。多糖可在温和条件下水解或者在剧烈条件（高温、较高浓度酸）下水解。在完全水解前，终止水解，可得到不同的寡糖片段和可能的多糖主链，然后综合采用单糖测定、甲基化分析和核磁共振等方法可深入解析多糖结构。3·2·3高碘酸氧化

高碘酸及其盐可以选择性地断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。糖的非还原末端或非末端的（1→6）-键与邻三元醇相似，其与过碘酸盐作用，糖环开裂得一分子比例的甲酸而消耗二分子比例的过碘酸盐。非末端的（1→2）-或（1→4）-键与邻二元醇相似，其开裂后产生二分子醛而消耗一分子比例之过碘酸盐。对于非末端的（1→3）-键或C-2和C-4有分枝的，则不受过碘酸盐影响。因此多糖氧化后定量测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比例，就可确定多糖中各种单糖的键型及其比例。多糖的过碘酸盐氧化一般在pH3~5的水溶液中进行（暗处）。过低pH导致酸水解，过高pH引起无选择性氧化。确定糖苷键的位置时，需要与Smith降解相结合。3·2·4Smith降解

Smith降解是将高碘酸氧化的产物还原后进行酸水解。由于糖基之间不同的位置缩合，因此用高碘酸氧化后生成不同的产物。将氧化产物用硼氢化钠还原成稳定的多羟基化合物，水解后用纸层析或者GLC（气液分配色谱法）鉴定水解产物，由降解的产物推断糖苷键的位置。由于实验中加入乙二醇终止反应，所以检测终产物中乙二醇没有意义，一般以甘油、赤藓醇和其它糖等作为糖苷键的特征终产物。3·2·5甲基化分析

甲基化分析是确定寡糖和多糖中单糖间糖苷键位置的重要手段。其原理是：先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，将甲基化多糖水解得到甲基化的单糖进行衍生处理，最后用GC-MS（气相色谱-质谱联用法）方法结合标准谱图分析，可得到部分甲基化单糖衍生物的归属，从而确定单糖残基的连接位点。同时根据不同甲基化单糖的比例推出这种连接键型在多糖重复结构中的比例。然而甲基化分析无法确定异头碳糖苷键构型和单糖残基的顺序信息。

多糖甲基化通过一系列的改进，目前有多种方法，如Purdie法、Haworth法、Menzies法、Hakomori法、Cicanu法、Needs法等，其中Needs改良的甲基化方法较为常用。针对易溶于水、难溶于DMSO（二甲基亚砜）的多糖，可以先用少量水使多糖溶解，再与DMSO混合，然后加入分子筛脱水，采用Needs法进行多糖甲基化，可得到甲基化程度比较完全的产物。在甲基化分析过程中，需要注意以下几点：

（1）多糖甲基化后用红外检测其是否含有羟基，如果仍有羟基峰存在，则表示甲基化不完全，需重复进行甲基化或者采用氯仿等溶剂将已甲基化的多糖萃取出来并作后续处理分析；

（2）含有糖醛酸或氨基己糖残基的多糖比较难甲基化，可能会产生二级产物。对于含有糖醛酸、氨基己糖以及某些取代基团的多糖，在甲基化分析时需要考虑甲基化和酸水解是否会引发副反应。3·3仪器分析法3·3·1紫外光谱法

紫外光谱法是多糖结构研究中常用的仪器分析方法之一，如采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等测定多糖含量，咔唑-硫酸法测定糖醛酸含量，柱层析过程中利用苯酚-硫酸法绘制多糖洗脱曲线，考马斯亮蓝法或Folin-酚试剂法测定多糖复合物中的蛋白含量等。在波长280、260nm处考察多糖中是否含有蛋白、核酸等。利用红外光谱中多糖的特征吸收峰，可鉴定多糖中糖的种类、糖环构型，提供异头碳的信息。3·3·2气相色谱法（GC）

气相色谱法主要用于单糖组成、糖醛酸种类和组成、Smith降解产物等分析。GC具有样品用量少、分辨率强、灵敏度高、分析速度快等优点，然而该法需要对多糖样品进行处理，衍生成易挥发、对热稳定的衍生物后再进行分析。液相色谱法（HPLC）也可用于糖的分析，如多糖纯化及其相对分子质量测定，单糖组成、糖醛酸种类分析以及糖含量测定，通常选用示差检测器。3·3·3质谱法

在糖类的研究中质谱法显示出不可替代的作用。GC-MS已广泛应用于糖组成分析和甲基化分析，以确定糖残基连接方式。上世纪80年代各软电离技术的诞生，如快原子轰击质谱（FAB-MS）、电喷雾质谱（ESI-MS）、基质辅助激光解析离子化质谱（MALDI-MS）等，使糖结构分析研究取得了日新月异的发展。3·3·4核磁共振（NMR）技术

NMR是研究多糖糖链结构的一种有效方法，常用来解决多糖结构中糖普键的构型和重复结构中单糖的数目。其中’H-NMR主要解决多糖结构中糖普键的构型问题;’3c-NMR的化学位移较’H-NMR宽，分辨率较高，因此不仅能够确定各种碳的位置，还能够区别分子的构型和构象。这种方法的显著优点是不破坏样品。3·4生物分析方法3·4·1

酶学法

酶学法主要是利用特异性糖苷酶对多糖分子进行酶切，可用于确定多糖的糖苷键类型，也可用于分析糖苷连接方式。到现在为止，已分离得到的糖苷酶有数十种。目前，最新酶学方法是试剂陈列分析方法(R拟姗)，根据这一方法原理，把酶学手段和仪器分析方法相结合，已经生产出新型的寡糖序列分析仪，但这还只适用于结构规律较明确的糖链。3·4·2

免疫学法

该方法的原理是一定结构的多糖会抑制抗原、抗体的结合。不同的糖有不同的抑制常数，因此当某种未知结构的糖链对抗原、抗体的结合产生了抑制作用，通过测定其抑制常数，再与已知结构的糖链作比较，如有相近抑制常数，其结构也会相似。

像上面提到的，多糖的结构分析方法很多，但是还没有一种方法可以单独完成多糖结构的分析，因此需要将各种方法结合起来才能完成多糖结构的分析。4天然产物活性多糖的生物活性功能

对多糖的功能研究主要集中在2个方面：一是作为非特异治疗剂，作用于相类似的对应分子，调节各种生理功能或纠正病理过程。二是作为信息分子进入机体，发挥补充调节或抑制的作用。4·1多糖的免疫调节作用

多糖的免疫调节功能是其最重要的功能活性，多糖能在多条途径、多个层面对免疫系统发挥作用。具体表现在：（1）提高巨噬细胞吞噬能力。

植物多糖对巨噬细胞的免疫调节作用主要表现在影响巨噬细胞活性氧的产生、细胞因子的分泌（如白细胞介素IL、肿瘤坏死因子TNF、干扰素IFN集落刺激因子CSF等）、细胞增殖和吞噬活性等，从而起到对天然免疫和适应性免疫的调控作用。从Aloebarbadensis分离得到的甘露聚糖表现出显著的刺激单核巨噬细胞生成的效应，车前子多糖具有抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性、刺激体外RAW264.7巨噬细胞增殖并提高NO释放的作用。（2）对T、B淋巴细胞的作用。香菇多糖是一种典型的T淋巴细胞增强剂，在体内外均能促进特异性细胞毒T淋巴细胞的产生，提高该细胞的杀伤活性。（3）对NK（自然杀伤细胞）、LAK（淋巴因子激活的杀伤细胞）的作用。大量的研究表明猕猴桃茎多糖、牛膝多糖等对NK、LAK细胞活性都有增强作用，其增强作用呈剂量依赖性。（4）通过不同途径激活补体系统。有些是通过替代通路激活补体，有些是通过经典途径，这一类多糖有柴胡多糖和三七多糖等。（5）以促进树突状细胞（DCs）增殖、表面表达分子MHCⅡ分泌等方式促进DCs诱导的免疫应答启动，比如灵芝多糖可明显刺激小鼠脾脏DCs增殖。大粒车前子多糖通过促进DCs表面MHCⅡ类分子、共刺激分子的表达及Th1型细胞因子的分泌，刺激T淋巴细胞的增殖，诱导Th1型免疫应答并增强CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤活力；通过促进DCs表面趋化因子受体CCR7mRNA的表达，促进DCs的移行和发育成熟，即通过对DCs移行、成熟、功能的上调作用而促进免疫应答的启动，增强机体的免疫功能。4·2多糖的抗肿瘤活性根据多糖的抗肿瘤作用将其可以分为两大类：

一类是具有通过激活机体的免疫系统，诱导细胞分化，刺激造血，抗转移，抗新生血管生成，诱导NO产生等生物活性的多糖，这类多糖与机体的免疫细胞通过分子水平的接触，免疫细胞被激活，释放出某些类型的细胞转导信号，从而激发和增强免疫反应，再通过增强机体的免疫功能间接抑制或杀死肿瘤细胞。具有抗肿瘤活性的多糖大多是通过这种途径发挥作用的。

另一类是具有细胞毒性的多糖，可以直接杀死肿瘤细胞，如牛漆多糖、青钱柳多糖和茶多糖均可以抑制癌细胞体外生长，青钱柳多糖可以显著抑制人宫颈癌Hela细胞的生长，诱使细胞发生凋亡，使细胞在S期发生阻滞。然而后一类多糖在体外直接杀伤肿瘤细胞的机制还不是很清楚。

4·3抗病毒作用

20世纪70年代以来，已经发现许多多糖具有抗疱疹病毒及流感病毒作用，如对艾滋病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等有明显的抑制作用。多糖通过以下方式达到抗病毒的作用：抑制病毒抗原的表达，抑制病毒逆转录酶的活性以及抑制病毒表面蛋白gp120与细胞表面CD4受体结合等。如灵芝中的糖蛋白是通过与病毒分子结合，阻止病毒分子与细胞之间的结合感染。硫酸多糖无论在体外还是在体内，都显示出不同程度的抗病毒活性。硫酸多糖包括从植物中提取到的各种肝素、硫氨多糖、天然中性多糖的硫酸衍生物和人工合成的硫酸多糖，是一类多聚阴离子多糖，带有大量负电荷。目前认为其抗病毒机理可能是硫酸多糖掩蔽了病毒或细胞表面的正电荷区域，从而抑制了病毒的吸附。有研究发现，匀多糖的硫酸酯抗病毒活性大于杂多糖硫酸酯的活性；相对分子质量大小、硫酸化程度、硫酸基的分布等因素均会对硫酸多糖的抗病毒活性有一定影响。4·4

抗氧化作用

许多从天然产物中分离得到的多糖类化合物具有清除自由基，抑制脂质过氧化、亚油酸氧化等抗氧化作用，其可能的抗氧化机理有：直接清除活性氧，络合产生活性氧所必需的金属离子，提高抗氧化酶的活性等。提示多糖的抗氧化性可能是抗肿瘤、抗衰老、抗感染等的作用机理之一。车前子多糖具有体外清除DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼

)自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基等抗氧化能力。从茶叶水提物中分离、纯化得到的3个多糖组分，其中相对分子质量为4.2×104的TPC-3组分的抗氧化能力明显高于相对分子质量为26.8×104和11.8×104的组分。黑灵芝多糖能抑制缺氧/复氧引起的LDH的释放及细胞活力的下降并呈剂量依赖性（可达100μg/mL），这种保护作用也伴随着减少MDA(丙二醛)的含量，增强SOD（超氧化物歧化酶）、CAT(过氧化氢酶)、GSH-Px（谷胱甘肽过氧化物酶

）活性及蛋白表达，并且能减少缺氧/复氧引起的ROS(活性氧族