Chapter4人类基因组的染色体作图课件

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4人类基因组的染色体作图一、人类基因定位方法二、人类染色体作图三、人类基因组的物理作图法

1一、人类基因定位方法(一)家系分析与基因定位(二)体细胞遗传学与细胞学图的制作(三)DNA介导的基因定位（核酸探针方法）

2（一）家系分析(PedigreeAnalysis)与基因定位

通过分析、统计家系中有关性状的连锁情况和重组率而进行基因定位的方法。fivemodesofMendelianinheritance：AutosomaldominantAutosomalrecessiveX-linkedrecessiveX-linkeddominant--rareY-linked--veryrare(hairyears)3CongenitalGeneralizedHypertrichosisisanX-linkeddominanttrait（先天性多毛症）Affectedfathershaveallaffecteddaughtersandnoaffectedsons.Affectedfemalesaremorecommonthanaffectedmales.Thetraitispresentineachgenerationorislost.4CongenitalGeneralizedHypertrichosisisonemedicalsyndromethatcouldhavecontributedtothewerewolfmyth.Scientistsareinterestedinthisatavisticsyndromeasitsunderstandingcouldshedlightonhowduringourevolutionwelosthairfrompartsofourbody.5EBWilson于1911年将红绿色盲基因首次定位到X染色体上。1968年Donahue利用系谱分析将Duffy血型基因定位于1号染色体上，这也是人类首次将基因定位于常染色体上。1号染色体长臂在靠近着丝粒区的地方变长，这一异常是遗传的，将其作为1号染色体上的一个特定的标记，随后发现这一标记与Duffy血型具有平行性，表明这种染色体的异常结构同这一基因相连锁，因此将此血型基因定位于1号染色体上。6外祖父法：确定X染色体上基因间的相对距离。根据双重杂合体母亲所生儿子中性状的重组情况，可以估算重组率。而母亲X染色体上的基因组成，可以由外祖父的表型获知。两对连锁基因时，双重杂合体母亲可能有两种连锁相：互引相：AG/ag------顺式相(cisphase)互斥相：Ag/aG------反式相(transphase)例如：人类色盲（a）和蚕豆病基因（G6PD）（g）71.若X染色体没有重组交换无论母亲顺式还是反式，儿子的X染色体只有两种。82.若母亲X染色体的两个基因间发生了重组交换9(二)体细胞遗传学与细胞学图的制作体细胞遗传学（somatiecellgenetics）

是以高等生物的体细胞为实验材料，采用细胞离体培养，细胞融合以及遗传物质在细胞间转移等方法，研究真核细胞内基因的结构、功能及其表达规律和条件等的遗传学分支学科。

意义：

可以绕过减数分裂过程，应用细胞培养方法，研究体细胞融合、突变、分离以及连锁和交换等等。把基因定位在染色体上，作成细胞学图。10

1、体细胞杂交定位

体细胞杂交又称体细胞融合，是指将两种基因型不同的体细胞融合成一个细胞的过程，这种融合后的细胞又称为杂种细胞，它兼有两种细胞的染色体。11经紫外处理的仙台病毒：具有附着点，能同时把两个细胞融合在一起两细胞靠近细胞膜融合，形成异核体细胞核融合形成杂种细胞继续分裂杂种细胞系培养多代其中一个物种的染色体随机丢失，最后只剩一条或几条1、人、鼠杂种细胞的获得12细胞融合

细胞核融合染色体丢失继续培养许多代，其中的一个物种的染色体逐渐随机丢失，最后只剩一条或几条。1314杂种细胞的筛选(HAT选择法)小鼠细胞株为胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）人体细胞株是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）这两种酶相对应的嘧啶和嘌呤核苷酸的代谢影响都不大，因此，两种细胞都可以在完全培养基中生长.152024/6/2715HAT培养基：

H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）

A为氨甲喋呤,是叶酸拮抗剂,可阻断细胞利用正常途径合成DNA.

T为在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料162024/6/2716因此在HAT培养基上:

人细胞：①由于A的存在，正常的DNA合成通路受阻。②同时由于HGPRT的缺乏，无法利用次黄嘌呤通过旁路合成DNA（嘌呤合成障碍）

鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，由于无TK，无法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍）

杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）172024/6/2717182024/6/2718192024/6/2719

人类染色体的丢失是随机的，所以各种杂种细胞系保留的人类染色体是不同的，从而可建立包括人类24条染色体在内的一整套杂种细胞，其中每个杂种细胞都包含有一组人类染色体，这一套杂种细胞株系称为克隆分布板(clonepanel)202、鉴别剩下的人类染色体

应用荧光染色法和其他特殊的染色技术，可使染色体纵长上呈现各种不同的分带（bands）。这些分带的位置、宽狭和浓淡等随染色体号码的不同而不同。但就某一种分带技术来说，每一染色体的分带模式（bandingpattern）是高度专一和稳定的。因而可用于人类染色体识别，追循染色体丢失过程。21223、基因定位同线测定：根据某一基因产物与某条人体染色体的同时存在或同时消失的现象来判断人类某一基因是否位于该染色体上。区域定位：利用染色体结构的变异，确定人类某个或某些基因在染色体的特定区域内（如用染色体易位，缺失作图）。23同线法进行人体基因的定位：人－鼠杂种细胞株编码GFEDCBA人类染色体号码－－－－－－－核苷磷酸化酶－－+－－－+

磷酸葡糖酸脱氢酶+－－－+－－苹果酸氧化还原酶－－+－－－+

羧肽酶C+－－－+－－异柠檬酸脱氢酶－－+－－－+

葡萄糖磷酸变位酶－1人类基因编码的酶+－－+－－－5－+－－－+－4－+－－+－+3+－－－+－－2－－+－－－+124

根据某一基因产物与某条人体染色体的同时存在或同时消失的现象来判断人类某一基因是否位于该染色体上，该方法叫同线测定。25杂种细胞系人体基因与染色体ABCDE

基因或基因产物opqr+-++-+-+---++++-----染色体序号123-+-+-----+++--+同线法进行人体基因定位o、q在不同的杂种细胞中同时出现，同时消失，表明二者连锁，且同2号染色体是同线关系，表明二者位于2号染色体上，同理，P位于1号染色体上,r位置待定26

利用染色体结构的变异，确定人类某个或某些基因在染色体的特定区域内（如用染色体易位，缺失作图）。基因剂量效应法：利用某一特定染色体片断缺失或重复后的病人或培养细胞内所观察到的基因剂量效应进行基因的区域定位。例如，发现先天愚型患者(21三体)的超氧化物歧化酶1(SOD—1)的基因的活性为正常人的1.5倍，于是将编码SOD-1的基因定位在21号染色体上。4、区域定位27染色体缺失定位法:在体外造成杂种细胞内特定染色体的不同位置发生断裂，形成各种类型的缺失末端，获得一套特定染色体的缺失杂种细胞，然后通过检测缺失杂种细胞内基因产物存在与否对许多基因进行区域定位。

28291、克隆基因定位法（p91）采用已克隆基因的cDNA探针与保留在杂种细胞内的人染色体DNA酶切序列进行分子杂交，来确定克隆基因所在的染色体。(三）DNA介导的基因定位（核酸探针方法）30以人体白蛋白基因cDNA为探针的克隆基因定位法电泳条带大小人细胞CHO中国仓鼠人CHO杂种细胞含4号染色体的杂种细胞不含4号染色体的杂种细胞阳性细胞阴性细胞3.5Kb√√√√√6.8Kb√√√因此，将此基因定位于4号染色体上312、原位杂交法

以标记的探针（同位素、生物素或荧光染料）直接同中期染色体进行原位杂交。32

把来自人类β珠蛋白基因的克隆DNA制备探针，与含有人体不同染色体组合的体细胞杂种杂交，发现只有携带人体第11号染色体的细胞株系才能与之杂交，于是就把这个基因定位于11号染色体上。33二、人类染色体作图

通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上的线性排列图称为遗传连锁图。

遗传图谱34物理图谱

这是一种高分辨率的染色体作图，是确定遗传标志或界标在染色体上所处的位置，以物理距离为图距单位，如bp，kp等。物理图阐明了基因之间的精确距离。35遗传标记：指可以明确反映遗传多态性的生物特征。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。36遗传标记的类型

形态学标记（morphologicalmarker）细胞学标记(cytologicalmarker)

生化标记(biochemicalmarker)DNA分子标记(molecularmarker)37形态学标记形态标记即个体的外部形态特征。简单直观、经济方便；但其数量有限、多态性较差表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。主要在早期使用。38细胞学标记细胞学标记即细胞染色体的变异。包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。与形态标记相比，优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。39生化标记生化标记包括同工酶和等位酶标记。分析方法是电泳和组织化学染色法,将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。优点：一是表现近中性，对生物经济性状一般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。缺点：一是可用标记数量少，二是染色方法和电泳技术有一定难度。40

DNA分子标记是指在DNA分子水平上，通过一定方式或特殊手段来反映生物个体之间或种群之间具有差异性状的DNA片段。它直接反映基因组DNA间的差异。分子标记41分子标记的优越性表现为：直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；表现为中性，不影响目标性状的表达；许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。42第一代分子标记，以Southern杂交技术为核心的分子标记，（如RFLP、VNTR）。第二代分子标记，以PCR技术为核心的分子标记，（如RAPD、AFLP、SSR）；第三代分子标记，单核苷酸多态性（SNP）标记。它也是以PCR技术为基础的分子标记技术。分子标记的三个阶段43第一代分子标记（基于Southern杂交技术的分子标记）1．RFLP标记限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）由于各种原因引起DNA内核苷酸排列顺序改变，当这种改变涉及到限制性内切酶识别位点时，利用限制性内切酶将DNA分子切割成许多长度不等的限制性片段，这些具有不同长度的限制性片段类型在人群中所呈现的多态分布现象就称为限制性片段长度多态性(RFLPs)

4445RFLP连锁分析:通过家系连锁分析,找出与突变基因相连锁的DNA多态性,并将其作为遗传标记追踪多态性在家族成员中的传递.46474849PH23kbMspIMspIPH19kbMspIMspIMspI③①②④23/1923/1923/2319/1923kb19kb①②③④利用RFLP对苯丙酮尿症进行基因诊断苯丙酮尿症:常染色体隐性遗传病Dd502．VNTR标记数量可变串联重复序列(variablenumberoftandemrepeat),重复单位6-12个bp（小卫星标记）在DNA的某些位置上这种串联成簇的重复单位数目不同,因此，用在串联重复序列两侧的限制内切酶酶切后，就会产生重复数目不等的片段。探针Ⅰ：位于此特殊VNTR附近独有的DNA片段。探针Ⅱ：根据VNTR多态性本身设计，可检测到所有相关的谱带。可作为DNA指纹分析。5152用内切酶把总DNA切成不同长度的片段（VNTR上没有酶切位点），再以VNTR中的特殊序列为探针进行Southern杂交，由于不同个体的这种串联重复的数目及位置不同，所以VNTR的Southern杂交谱带具有高度的个体特异性，故又称其为DNA指纹（DNAfingerprints）。5354M1M3M2M3M1M4M1M3M2M4M2M455M2M156第二代分子标记1.RAPD标记随机扩增多态DNARandomlyamplifiedpolymorphic

以单一的随机引物(一般为10个碱基)，利用PCR技术，随机扩增未知序列的基因组DNA（非定点的扩增基因组DNA）获得的DNA片段长度变异。57RAPD标记的特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传，不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便；（4）DNA样品需要量少，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。582.AFLP标记扩增酶切片段长度多态性amplifiedfragmentlengthpolymorphic基本原理：AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。5960AFLP标记的特点：由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以标记数目是无限多的；可同时检测多个座位，多态性极高；表现共显性；分辩率高，结果可靠；目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。613．STR标记（简单序列重复）短串联重复序列（shorttandemrepeat）

STR标记又叫微卫星DNA标记（SSR

），它是指基因组中存在的由2-6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于真核生物基因组中。

62特点：①

高度多态。②

高频率性、分布广、平均分布。③

STR两侧有特异性单拷贝顺序。④

相对容易进行PCR微卫星已成为取代RFLP的第二代分子标记6364微卫星DNAPCR扩增结果（示例）：500bp400bp300bp240bp

该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。微卫星DNA差异最小只相差2个碱基（重复片段只有2个碱基）。6566第三代分子标记：SNP(singlenucleotidepolymorphism)单核苷酸多态性SNP就是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的核苷酸，且其出现频率大于1%。指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入.1996年美国E.S.Lander提出，称为第三代DNA遗传标记67AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT个体A个体B个体C

SNP分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每1300个bp存在一个。在人类DNA序列变异中，SNP占90%。

单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。目前已知基因组中含有150万个SNP68三、人类基因组的物理作图法

以特定