浙科版高考生物一轮复习热点练9新情境下基因工程的综合应用课件

热点练(九)新情境下基因工程的综合应用12341.(2023浙江温州二模)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质,决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示,其中A链为编码链、B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞,获得对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。1234

图1 图2注:XhoⅠ、KpnⅠ、PstⅠ为不同限制酶的识别位点;LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色;ampr基因为氨苄青霉素抗性基因。1234回答下列问题。(1)获取目的基因提取枣树细胞的

,经逆转录获得cDNA。为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接,克隆MT基因时应选择的引物组合是

,并在其

(填“5'”或“3'”)末端分别添加限制酶

的识别序列。

mRNA引物Ⅱ和引物Ⅲ5'Kpn

Ⅰ和Xho

Ⅰ1234(2)构建重组DNA分子①启动子是

识别并结合的部位;基因工程中构建用于原核生物的表达载体时,常用的启动子不包括以下哪一项?

(A.噬菌体基因启动子

B.乳酸菌基因启动子C.大肠杆菌基因启动子D.枣树MT基因启动子)②影响DNA连接反应的主要因素除pH与温度等操作环境、反应时间、DNA连接酶的种类及浓度外,还有

等(答出1项即可)。

RNA聚合酶D载体浓度、目的基因浓度、载体和目的基因的比例1234(3)导入、筛选和鉴定MT工程菌①将得到的混合物导入到用

处理的大肠杆菌完成

实验。②将菌液稀释并涂布在含X-gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后,随机挑取

的单菌落可获得MT工程菌。

③欲进一步对MT工程菌进行鉴定,可将挑取出的MT工程菌与

分别接种至含

的LB液体培养基中,置于恒温培养箱中培养,适宜时间后检测菌种数量。

Ca2+转化白色普通大肠杆菌(一定浓度的重金属)镉1234(4)扩大菌种将MT工程菌接种至发酵罐内进行扩增,培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对

(填“菌体”或“菌落”)进行直接计数,以评估增殖情况。发酵结束后,采用

(答出1项即可)等方法获得所需的发酵产品。

菌体过滤、沉淀、离心、静置1234解析

(1)mRNA经过逆转录可获得cDNA。引物能使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,故应选择引物的方向是从5'端→3'端延伸,即引物Ⅱ和引物Ⅲ。限制酶序列应添加在基因的外侧,不影响基因的序列,故添加在5'端。因为B链为模板链,转录的方向是沿着模板链的3'端→5'端,应将MT基因的左端与启动子一侧连接,又因为目的基因中含有PstⅠ的识别序列,故添加的限制酶序列分别是XhoⅠ和KpnⅠ。1234(2)①启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,紧挨转录的起始位点,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。乳酸菌和大肠杆菌都是原核生物,启动子可以用于构建原核生物的表达载体;噬菌体是寄生于细菌中的病毒,可在特定细菌内繁殖,启动子可用于构建原核生物表达载体;枣树MT基因启动子只能在特定枣树细胞中发挥作用,不适合用于构建原核生物表达载体,故选D。②DNA连接反应是酶促反应,影响因素除了pH与温度、反应时间、DNA连接酶的种类及浓度外,还有载体浓度、目的基因浓度、载体和目的基因的比例等。1234(3)①用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于易于吸收外源DNA的状态;将基因表达载体导入受体细胞以完成转化实验。②在含有X-gal和氨苄青霉素的培养基上,导入空白质粒和重组质粒的大肠杆菌都可以形成菌落,但导入重组质粒的大肠杆菌LacZ基因被破坏,不能催化无色物质X-gal产生蓝色物质,菌落为白色,故应挑取白色单菌落进行培养。③MT工程菌的特点是对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力,欲进一步对MT工程菌进行鉴定,可将挑取出的MT工程菌与普通大肠杆菌分别接种到含有重金属镉的LB液体培养基中,置于恒温培养箱中培养,适宜时间后检测菌种数量。(4)细菌计数板可对菌体直接计数。若要获得发酵产品,可采用过滤、沉淀、离心、静置等方法。12342.(2023浙江名校协作体高三二模)番茄的果实营养丰富,是深受人们喜爱的蔬果,但番茄不抗冻,在我国冬季无法栽培。现有科研人员利用转基因技术,将北极海鱼中的抗冻基因转入到了番茄细胞中,从而成功培育抗冻番茄。导入目的基因的方法是农杆菌转化法,图1为培育过程使用的Ti质粒,已知Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。回答下列问题。图1图21234(1)若经过诱变,北极海鱼的一条染色体上的抗冻基因发生了碱基对的替换,导致抗冻能力大大增强,通过琼脂糖凝胶电泳,能否区分突变前后的两个抗冻基因?

,请说明理由:

。(2)对于目的基因的获取,研究人员提取了抗冻蛋白,根据氨基酸序列分析了mRNA的碱基序列,继而合成了抗冻基因,通过这种方法得到的目的基因因不含

、

,故无法扩增和表达。选择图示Ti质粒构建基因表达载体,应选择限制酶

(填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”),不选其他限制酶的理由是

。

限制酶Ⅰ会破坏四环素抗性基因,影响后续含目的基因的受体细胞的筛选,限制酶Ⅱ会破坏Vir区基因,影响目的基因的转移不能因为碱基对的替换,突变前后基因长度相同,无法通过琼脂糖凝胶电泳区分复制起点启动子和终止子Ⅲ1234(3)为筛选成功导入抗冻基因的番茄细胞,在培养基中添加

。将筛选后获得的番茄细胞经

过程形成愈伤组织后,经器官发生途径或

途径发育形成植株,再在

条件下筛选出具有抗冻性状的番茄植株。

四环素脱分化体细胞胚胎发生低温/寒冷1234(4)研究人员欲比较不同转基因番茄中抗冻蛋白的合成量,制备相应的单克隆抗体,利用图2所示原理进行检测。①检测前,先将抗冻蛋白的单克隆抗体固定在支持物上,然后向该检测体系中加入一定量的番茄植株中提取的蛋白质(待测抗原)和等量酶标记抗冻蛋白(酶标记抗原),目的是让待测抗原、酶标记抗原与抗体

结合。②保温一段时间后洗涤,再向检测体系中加入一定量的白色底物,若检测体系蓝色越

,则说明番茄提取物中抗冻蛋白的含量越高。

③本检测方法中的单克隆抗体可经杂交瘤细胞体外培养或注射到小鼠腹腔克隆化培养后,分别从

、

中提取。

竞争性浅细胞培养液小鼠腹水1234解析

(1)因为碱基对的替换,突变前后基因长度相同,无法通过琼脂糖凝胶电泳区分。(2)研究人员提取了抗冻蛋白,根据氨基酸序列分析了mRNA的碱基序列,推测出目的基因的碱基序列,合成抗冻基因,通过这种方法得到的目的基因因不含复制起点、启动子和终止子,故无法扩增和表达。构建重组DNA分子时,限制酶Ⅰ会破坏四环素抗性基因影响后续的筛选,限制酶Ⅱ会破坏Vir区基因影响目的基因的转移,因此构建重组DNA分子时,选择的限制酶最好是限制酶Ⅲ。1234(3)在培养基中添加四环素,可以筛选成功导入抗冻基因的番茄细胞。由分化细胞形成愈伤组织的过程叫脱分化;愈伤组织发育成植株的两个途径为器官发生途径和体细胞胚胎发生途径;要筛选具有抗冻性状的番茄,应在低温(或寒冷)的条件下进行。(4)根据图示反应原理,待测抗原中的目标抗原和酶标记抗原竞争结合抗体,标记抗原的酶可催化白色底物变为蓝色产物,所以如果待测抗原中目标抗原越多,则酶标记抗原和抗体结合得越少,催化生成的蓝色产物就越少,检测体系蓝色就越浅。本检测方法中的单克隆抗体可经杂交瘤细胞体外培养或注射到小鼠腹腔克隆化培养后,分别从细胞培养液、小鼠腹水中提取。12343.(2023浙江名校新高考研究联盟第三次联考)白细胞介素-6(IL-6)在医学中被广泛应用,科研人员进行了利用大肠杆菌作为生物反应器生产重组人源白细胞介素-6(rhIL-6)的相关实验研究。回答下列问题。(1)若利用化学方法合成rhIL-6基因,通常需先根据IL-6的

设计出rhIL-6的基因序列,在设计时,还要尽可能依据

细胞偏好的密码子。在利用PCR扩增rhIL-6基因时,为提高引物与模板结合的效率,设计引物需避免2个引物或1个引物不同区段的碱基序列

。在构建重组质粒时,要选择在宿主菌中

水平高的质粒作为载体。氨基酸序列大肠杆菌互补表达1234(2)将大肠杆菌用

处理后,加入重组质粒,悬浮培养一段时间后,

并获取沉淀,经稀释后再用

法接种到含有氨苄青霉素的平板上进行筛选,长出的菌落再利用核酸分子杂交进行鉴定。

Ca2+离心稀释涂布平板1234(3)将阳性细菌进行克隆化培养,利用凝胶电泳分离并检测rhIL-6蛋白。完善下列实验思路:①将SDS制成电泳所需的凝胶,凝胶的孔隙可起到分子筛的作用,理论上SDS制备的凝胶孔径应比琼脂糖凝胶孔径

。

②将凝胶块放入电泳槽中,加入缓冲液,缓冲液

(填“需要”或“不需要”)淹没凝胶块。

③将蛋白质样品加入加样孔中,进行电泳。④用缓冲液将电泳后的凝胶块中的蛋白质转移到特殊的膜上,再利用具有荧光或放射性的

作为探针进行检测。

小需要抗rhIL-6抗体1234(4)SDS可使蛋白质空间结构改变,所以电泳时蛋白质在凝胶中移动的快慢主要由

和电场大小决定。若上述实验结果出现“微笑”或“皱眉”等条带不整齐现象(如下图1、2),其可能的原因包括下列哪几项?

。(A.凝胶冷却不均匀B.凝胶底部混有气泡C.靠近隔片的凝胶聚合不完全D.样品溶解不佳)

分子大小(或分子量)ABC1234(5)将筛选出的大肠杆菌进行发酵试验,发酵过程中需要控制发酵液的

、渗透压、pH、营养物质和代谢废物浓度等条件,由于发酵过程中pH会发生变化,所以在定时补充营养物质时还需补充

。

温度(氧气浓度)碱性物质1234解析

(1)如果基因比较小,核苷酸序列已知,可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成,先根据IL-6的氨基酸序列设计出rhIL-6的基因序列。该研究利用大肠杆菌作为生物反应器,因此在设计时,要尽可能依据大肠杆菌细胞偏好的密码子。利用PCR扩增rhIL-6基因时,为提高引物与模板结合的效率,设计引物需避免2个引物或1个引物不同区段的碱基序列互补。在构建重组质粒时,要选择在宿主菌中基因表达水平高的质粒作为载体。(2)用Ca2+处理大肠杆菌可以使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,加入重组质粒与大肠杆菌混合,在一定的温度下促进大肠杆菌吸收DNA分子,完成转化过程。大肠杆菌会沉淀在底部,因此可离心后获取沉淀,经稀释后再用稀释涂布平板法接种到含有氨苄青霉素的平板上进行筛选,长出的菌落再利用核酸分子杂交进行鉴定。1234(3)将SDS制成电泳的凝胶,凝胶孔隙可起到分子筛的作用,因此制备的凝胶孔径应比琼脂糖凝胶孔径小。将凝胶块放入电泳槽中,加入缓冲液,缓冲液需要淹没凝胶块。对于rhIL-6蛋白,可用抗原-抗体杂交技术进行检测,即利用具有荧光或放射性的抗rhIL-6抗体作为探针进行检测。(4)SDS能使蛋白质发生完全变性,所以电泳时蛋白质在凝胶中移动的快慢主要由蛋白质分子大小和电场大小决定。电泳条带不整齐可能是由于凝胶冷却不均匀、凝胶底部混有气泡、靠近隔片的凝胶聚合不完全等原因,故选A、B、C。1234(5)大肠杆菌发酵过程中需要控制发酵液的温度、氧气浓度、渗透压、pH、营养物质和代谢废物浓度等条件。发酵过程中大肠杆菌会生成CO2,CO2溶于水可使pH下降,所以为维持pH的相对稳定,在定时补充营养物质时还需补充碱性物质。12344.(2024浙江金华模拟)P24是HIV病毒颗粒的主要结构蛋白(大小约为26KD),是P24基因的表达产物。P24单克隆抗体在HIV感染的诊断、治疗等方面有重要意义,P24单克隆抗体的制备主要包括三个阶段:利用基因工程生产P24蛋白;利用细胞融合技术生产单克隆抗体;单克隆抗体活性的鉴定。请回答下列问题。(1)提取HIV的总RNA,经

过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出P24基因的cDNA,原因是

。引物是根据P24基因对应的cDNA的一段已知序列设计合成的(含有/加入了能与之特异性结合的引物)

逆转录1234(2)在构建重组质粒时,需对质粒和P24基因的cDNA用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切,双酶切的优点是

。研究发现,P24基因的cDNA缺乏这两种限制酶的识别序列。为此,在设计PCR引物时,需要

。

防止质粒和目的基因的自身环化及质粒和目的基因的反向连接在引物中加入限制酶BamHⅠ和XhoⅠ的识别序列1234(3)将重组质粒(含卡那霉素抗性基因)导入宿主菌体细胞后,进行的部分操作及结果如下图所示。图中①②两处的接种方法

(填“相同”或“不同”),在固体平板培养基上能生长的菌落不一定能合成P24,其原因是

。蛋白凝胶分析结果图中,1为蛋白Marker,2为不含物质A的菌液,3为含物质A的菌液,实验结果说明P24较高的是

(填“2”或“3”),据此推测物质A的作用是

。

不同重组质粒表达了卡那霉素抗性基因,但不一定表达了P24基因3物质A能诱导P24基因的表达1234(4)用P24蛋白对小鼠以静脉注射的方式进行加强免疫3次,其目的是

。取免疫后小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞,用

促融,并经HAT培养基筛选获得杂交瘤细胞。进一步筛选时,需先对含杂交瘤细胞的培养液进行稀释,然后用抗原-抗体杂交技术进行检测,筛选出具有

特性的细胞。再将所得细胞进行克隆培养,进而获得P24单克隆抗体。克隆培养的关键是