抗阿尔兹海默症灯盏乙素苷元衍生物设计、合成及活性研究

背景介绍阿尔兹海默症（AD）是一种渐行性神经退行性疾病，是导致痴呆的主要原因。灯盏乙素及其活性代谢物灯盏乙素苷元（Scutellarein）具有广泛的药理活性，包括抗氧化、神经保护、金属螯合和抗炎特性，以及改善Aβ诱导的损伤等，表明灯盏乙素可能成为治疗AD的有利药物。基于AD这种神经退行性疾病表现出复杂的发病机制表明，人们的注意力正转向探索多靶点定向配体策略（MTDLs），即单个药物分子可以同时与疾病病理相关的多个靶点结合并调节。本文亮点1、根据多靶点定向配体策略，以灯盏乙素苷元为骨架，通过不同的连接体，连接N，N-双取代氨基甲酸酯片段和炔丙胺，N-甲基炔丙胺片段，设计并合成抗AD灯盏乙素苷元衍生物；2、基于AD的胆碱酯酶假说和单胺氧化酶假说，根据Ellama法和Holt法，进行酶活性测试，2-(4-((二甲基氨基甲酰基)氧基)苯基)-5，6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯对两种酶表现出较好的抑制活性；3、目标化合物可能是一个具有潜力的抗AD化合物，有待在抗氧化活性、金属离子螯合、肝微粒体代谢等抗AD活性实验中进一步研究。内容介绍1实验部分1.1

主要仪器与试剂1.2

实验步骤1.2.1

灯盏乙素苷元的制备3mol/L硫酸-95%乙醇溶液的制备：①先配制95%乙醇：取950mL的无水乙醇于1000mL容量瓶中，用超纯水定容，摇匀，装入备用瓶。②取163mL(18.4mol/L)浓硫酸，少量多次加入到盛有上述95%乙醇的大烧杯中，勤搅拌，待冷却后，转移至1000mL容量瓶，用95%乙醇定容，摇匀备用。苷元的制备：取2.00g灯盏乙素于250mL的圆底烧瓶中，加入180mL的上述硫酸-乙醇溶液，80℃回流20h，至橘红色澄清液体。反应结束后，倒入盛有2L冰水的大烧杯中，待沉淀析出完全后，抽滤，超纯水反复洗涤滤饼至中性，用无水乙醇溶解并减压旋干，得到黄色灯盏乙素苷元粗品，产率70%，直接用于下一步反应。1.2.2

二苯缩酮保护的灯盏乙素苷元的合成在250mL的干燥洁净圆底烧瓶中，加入500mg(1.75mmol)灯盏乙素苷元，加入14mL二乙二醇二甲醚(DEME)将苷元溶解，加入251.6mg(1.75mmol)对二甲氨基吡啶(DMAP)，常温搅拌下缓慢滴加二氯二苯甲烷，滴毕，将体系升温回流反应2h。反应结束后，加入适量石油醚，待晶体析出完全后，去上清液，残余物经硅胶柱层析分离纯化，洗脱剂为V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1：70，得橘黄色粉末，产率为65%。1.3

胆碱酯酶活性测试以及酶动力学测试采用Ellman法对目标化合物进行胆碱酯酶活性测试。96孔板中依次加入140μLPBS、20μL酶、20μL待测物或对照品(测试组),同时设置测试本底组(20μLPBS代替酶溶液)、空白组(20μLPBS代替待测化合物或对照品)、空白本底组(180μLPBS)。37℃培养20min后，依此加入现配的10μLDTNB和10μL的ATCI，每孔溶液总体积为200μL。37℃培养10min后，然后立刻使用酶标仪测试化合物在412nm处的OD值。每组数据重复做3次，取平均值。根据公式计算抑制率，用GraphPadPrism8.0计算出化合物抑制胆碱酯酶的IC50。抑制率(%)=[1-(OD测试组-OD本底组)/(OD空白组-OD空白本底组)]×100%1.4

单胺氧化酶活性测试1.5

化合物抑制/解聚Aβ1-42聚集活性实验1.6

透射电镜(TEM)观察Cu2+诱导的Aβ1-42聚集/解聚2结果与讨论2.1

酶活性测试结果如表1所示，所有的目标化合物对eeAChE均显示了不同程度的抑制活性，IC50值范围为3.50~12.69μmol/L，均优于阳性药，这表明N,N-双取代氨基甲酸酯的引入是抑制胆碱酯酶活性的关键。其中化合物4b、4c、6a抑制作用较好，有待进一步的研究。2.2

酶动力学实验结果基于上述结果，选择化合物6a进行eeAChE动力学研究，结果如图10a所示，eeAChE的Lineweaver-Burker图中所有的直线在第三象限中相交于一点，随着化合物(抑制剂)浓度的增加，斜率和截距都增加(即Vmax减少，Km增加)，这一结果表明，化合物对eeAChE抑制机理为混合型抑制。以Lineweaver-Burker图中斜率对化合物浓度作图，如图10b所示，得抑制常数Ki值为3.61，表明化合物的抑制能力较强。2.3

抑制/解聚Aβ1-42聚集活性实验结果如表2所示，所有化合物均有抑制Aβ1-42聚集的作用。除化合物4a、4b、4c外，其余6个化合物抑制Aβ1-42聚集的作用远高于灯盏乙素和姜黄素。选择化合物5a、5b、6a、6b进一步考察其抑制Cu2+诱导的Aβ1-42聚集，以及解聚自诱导和Cu2+诱导的聚集，结果如表2。化合物6a抑制自身诱导和Cu2+诱导的抑制率为87.57%和75.01%；化合物6a解聚自身诱导和Cu2+诱导的解聚率为82.22%和77.40%，均优于灯盏乙素和姜黄素。2.4

透射电镜(TEM)观察Cu2+诱导的Aβ1-42聚集/解聚结果见图11，未孵育过的Aβ1-42在电镜下呈比较规整分散的圆形颗粒，Aβ1-42与Cu2+单独孵育24h后聚集成不规则的纤维状，Aβ1-42与Cu2+单独孵育48h后聚集成不规则的纤维状较24h更明显。加入姜黄素和化合物6a后，聚集减少，且与化合物6a孵育的Aβ1-42聚集程度比与姜黄素孵育的Aβ1-42聚集程度明显减少。表明化合物能够有效抑制/解聚Cu2+诱导聚集，且抑制/解聚Cu2+诱导聚集的效果比姜黄素要好。透射电镜结果与硫磺素T法测得的结果一致。3结论根据多靶点导向配体策略(MTDLs)，设计并合成9个双靶点抗阿尔兹海默症灯盏乙素苷元衍生物。结构通过1HNMR、13CNMR、ESI-MS进行确证，9个终产物(化合物4a~4c、化合物5a~5c、化合物6a~6c)总产率范围在14.46%~19.37%之间。基于AD的胆碱酯酶假说和单胺氧化酶假说，根据Ellama法和Holt法，进行酶活性测试。结果表明，2-(4-((二甲基氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯(6a)对两种酶表现出较好的抑制活性，对eeAChE的IC50为(5.06±1.59)μmol/L，对MAO-B的IC50为(23.61±0.27)μmol/L。化合物6a与eeAChE的酶动力学表明化合物6a对eeAChE是混合型抑制。化合物6a不仅对自身和Cu2+诱导的Aβ1-42聚集具