(高清版)GBT 40049-2021 鸡肠炎沙门氏菌PCR检测方法

ICS11.220国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40049—2021本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SC/TC181)归口。1GB/T40049—2021鸡肠炎沙门氏菌PCR检测方法本标准规定了鸡肠炎沙门氏菌分子分型的PCR检测方法。本标准适用于各种日龄的鸡及其产品中携带的肠炎沙门氏菌的PCR方法检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.4—2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T28642—2012饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚合酶链式反应(PCR)法NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1生物体在生理、病理和不同发育阶段的在所有类型的细胞中都表达的一类基因。这类基因高度保守，基因产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)5试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯。实验用水均符合GB/T6682—2008二级水规定。5.1LB液体培养基(配制方法见附录A中A.1)。5.2缓冲蛋白胨水(BPW)前增菌液(配制方法见A.2)。5.3亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液(配制方法见A.3)。5.4四硫磺酸盐煌绿(TTB)增菌液(配制方法见A.4)。5.5木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂D.3(配制方法见A.5)。5.6TAE电泳缓冲液(配制方法见A.6)。5.7阳性、阴性对照：阳性对照为肠炎沙门氏菌标准株(CVCC3377)培养液、鸡白痢沙门氏菌标准株2GB/T40049—20215.142×PCRMix。6.1恒温培养箱(温度范围：5℃~50℃,温度均匀度：≤±1℃)。6.2高压灭菌锅(灭菌温度：105℃~135℃,工作压力：≤0.35MPa)。6.3电子天平(感量0.001g)。6.4高速离心机(可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上)。6.5二级生物安全柜。6.64℃冰箱(温控范围2℃~8℃);—20℃冰箱。6.7PCR仪。6.8电泳仪(电压90V～120V)。6.10电泳仪(电压90V～120V)。6.11控温摇床(温度范围：5℃~50℃,振荡频率：30r/min～300r/min)。6.12凝胶成像仪。6.13PCR反应管。6.141.5mL带盖离心管。名称和采样日期，冷藏运送到实验室进行检测。按照NY/T541—2016中6.2执行。按照NY/T541—2016中6.7.2执行。按照NY/T541—2016中6.8.1执行。按照NY/T541—2016中6.8.2执行。3GB/T40049—2021按照GB4789.4—2016执行，进行分离、培养，至生化试验部分，完成疑似沙门氏菌菌株的初步鉴定。8鸡肠炎沙门氏菌的PCR检测方法8.1细菌基因组DNA提取将初步鉴定为沙门氏菌的菌株用商品化试剂盒进行基因组DNA提取。提取方法按试剂盒说明书要求进行。设计合成七个持家基因的引物。引物DNA序列参见B.1。8.3持家基因PCR扩增用B.1中所列七对引物对样品基因组DNA的七个持家基因分别进行PCR扩增。具体实验操作符合GB/T28642—2012检测技术要求。50μLPCR反应体系参见B.2。PCR反应程序：94℃5min;94℃45s,55℃45s,72℃1min,共35个循环；72℃7min;4℃保存。取5μL～10μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(电泳方法参见GB/T28642—2012),电泳结束将七个持家基因均扩增出特异性条带的PCR产物进行测序。利用B.1规定的七对引物，阳性对照菌株PCR产物电泳后分别出现七条特异性的扩增条带，阴性对照PCR产物无扩增条带，试验结果成立。否则试验不成立。七个持家基因的PCR产物电泳图参见附录C。使用DNA序列分析软件，将七个持家基因PCR产物DNA序列与附录D所列参考序列分别进行一对一比对(部分基因提供了2个～3个参考序列)。七个基因的测序结果与附录D中所对应的参考序列(或之一)均完全一致(即：所测aroC基因序列所测hemD基因序列与D.3中序列完全一致、所测hisD基因序列与D.4.1或D.4.2中序列之一完全4GB/T40049—2021一致、所测purE基因序列与D.5.1或D.5.2中序列之一完全一致、所测sucA基因序列与D.6.1或D.6.2中序列之一完全一致、所测thrA基因序列与D.7.1或D.7.2或D.7.3中序列之一完全一致),则可判定样品为肠炎沙门氏菌阳性。5(规范性附录)培养基配制A.1LB液体培养基胰蛋白胨5g酵母提取粉10g氯化钠10g将各成分加入水中，搅混均匀，121℃±2℃高压灭菌15min,冷却后备用。A.2BPW前增菌液蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠(含12个结晶水)9.0g磷酸二氢钾1.5gA.2.2制备将各成分加热溶解于1000mL水中，121℃±2℃高压灭菌15min,冷却后备用。A.3SC增菌液蛋白胨5.0g亚硒酸氢钠4.0g磷酸氢二钠10.0gL-胱氨酸0.01gA.3.2制备将各成分加热溶解于1000mL蒸馏水中，无菌操作分装于灭菌三角瓶或试管中备用。当天制备当天使用，无需高压灭菌。6GB/T40049—2021A.4TTB增菌液A.4.1成分蛋白胨9.0g牛肉粉4.5g氯化钠2.7g碳酸钙40.5g胆盐5.0g硫代硫酸钠50.0g将各成分溶解于1050mL蒸馏水中，加热煮沸，临用前加入20%碘液20mL,0.1%煌绿10mL,现配现用。A.5XLD鉴别培养基酵母浸粉3.0gL-赖氨酸5.0g木糖3.75g乳糖7.5g蔗糖7.5g柠檬酸铁铵0.8g硫代硫酸钠6.8g氯化钠5.0g苯酚红0.08gpH7.4±0.225℃A.6TAE电泳缓冲液40mmol/LEDTA(pH8.0)GB/T40049—2021先按A.6.1所示成分配制50×TAE电泳缓冲液，将其用蒸馏水50倍稀释即为工作浓度。8GB/T40049—2021(资料性附录)测序引物与反应体系B.1七个持家基因测序引物见表B.1。表B.1七个持家基因片段PCR引物序列基因名称引物序列片段大小F5'-GTCACGGTGATCGATCCGGT-3′R5'-CACGATATTGATATTAGCCCG-3′F5'-CCTGGCACCTCGCGCTATAC-3'R5'-CCACACACGGATCGTGGCG-3'F5'-ATGAAATTTACCGTTGAACGTGA-3′R5'-AATTTCTCATTCGAGAGGATTGC-3′F5'-AGCACCGAAGAGAAACGCTG-3'R5'-GGTTGTTGATAACGATACGTAC-3′hisDF5'-TCGCGTCTGTCGGTCTGTAT-3′R5'-GGCGCAGTATAGCCATAGGT-3'hemDF5'-ATGAGTATTCTGATCACCCG-3'R5'-ATCAGCGACCTTAATATCTTGCCA-3purEF5'-GACACCTCAAAAGCAGCG-3'R5'-CGAGAACGCAAACTTGCTTC-3′B.2PCR反应体系见表B.2。表B.2PCR扩增反应体系组分体积/μLddH₂O2×PCRMix25.0F上游引物R下游引物总体积9GB/T40049—2021(资料性附录)七个持家基因PCR电泳图肠炎沙门氏菌阳性菌株七个持家基因PCR电泳图见图C.1。说明：2——sucA; 6———dnaN;7——aroC;MDNAMarkerTrans2K。图C.1阳性对照菌的七个持家基因PCR扩增结果电泳图(资料性附录)七个持家基因DNA序列D.1.1aroC5/aroC454GTTTTTCGTCCGGGACACGCGGATTACACCTATGAGCAGAAATACGGCCTGCGCGATTACCGTGGCGGTGGACGTTCTTCCGCGCGTGAAACCGCGATGCGCGTAGCGGCAGGGGCGATCGCTACCTGGCGGAAAAGTTCGGCATCGAAATCCGCGG(C/T)TGCCTGACCCAGATGCTGGAGATTAAAGACTGGCGTCAGGTTGAGCTTAATCCGTTCTTTTGTCCCGATGCGGACAAACTTGACGCGCTGGACGAACTGATGCGCGCGCTGAAAAAAGAGGACGGTGATGGCGAGCGGCGTGCCGGCAGGGCTTGGCGAACCGGITTl"IGACCGACTGGATGCGGACATCGCCCATGCGCTGATGAGCATCAATGCGGTGAAAGGCGTGGAGATCGGCGAAGGATITAACGTGGTGGCGCTGCGCGGCAGCCAGAATCD.1.2aroC41GTITTTCGTCCGGGACACGCGGATTACACCTATGAGCAGAAATACGGCCTGCGCGATTACCGTGGCGGTGGACGTTCTTCCGCGCGTGAAACCGCGATGCGCGTAGCGGCAGGGGCGATCGCCTACCTGGCGGAAAAGTTCGGCATCGAAATCCGCGGCTGCCTGACCCAGATGGGCGACATTCCGCTGGAGATTAAAGACTGGCGTCAGGTTGAGCTTAATCCGTTCTTTTGCCCCGATGCGGACAAACTTGACGCGCTGGACGAACTGATGCGCGCGCTGAAAAAAGAGGGTGACTCCATCGGCGCGAAAGTGACGGTGATGGCGAGCGGCGTGCCGGCAGGGCTIGGCGAACCGGTATITGACCGACIGGATGCGGACATCGCCCATGCGCTGATGAGCATTAATGCGGTGAAAGGCGTGGAGATCGGCGTGGTGGCGCTGCGCGGCAGCCAGAATCGCGATGAAATCACGGCGCAGGGTD.2dnaN基因D.2.1dnaN2/dnaN494ATGGAGATGGTCGCGCGCGTTACGCTTTCTCAGCCGCATGAGCCGGGCGCCACTACCGTGCCGGCGCGGAAATTCTTTGATATCTGCCGCGGCCTGCCGGAGGGCGCGGAGATTGCCGTTCAGTTGGAAGGCGATCGGATGCTGGTGCGTTCTGGCCGTAGCCGCTTCTCGCTGTCTACGCTGCCTGCCGCCGATTGB/T40049—2021TCCCGAATCTTGACGACTGGCAAAGCGAAGTTGAATTTACGCTGCCGCAGGCCACGATGAAGCGCCTGATTGAAGCGACCCAGTTTTCGATGGCTCATCAGGATGTGCGCTACTACTTAAACGGTATGCTGTTTGAAACGGAAGGTAGCGAACTGCGCACTGTCGCGACCGACGGCCACCGC(C/T)TGGCGGTGTGCTCAATGCCGCTGGAAGCGTCTTTACCCAGCCACTCGGTGATTGTGCCGCGTAAAGGCGTGATTGAACTGATGCGTATGCTCGACGGCGGTGAAAACCCGCTGCGCGTGCAGD.2.2dnaN67ATGGAGATGGTCGCGCGCGTTACGCTTTCTCAGCCGCATGAGCCAGGCGCCACTACTGTGCCGGCGCGGAAATTCTTTGATATCTGCCGCGGCCTGCCGGAGGGCGCGGAGATTGCCGTTCAGTTGCGATCGGATGCTGGTGCGTTCTGGCCGTAGCCGCTTCTCGCTGTCTACACTGCCTGCCGCCGATTCCGAATCTTGACGACTGGCAAAGCGAAGTTGAATTTACGCTGCCGCAGGCCACGATGAAGCGCCTGATTGAAGCGACCCAGTTTTCGATGGCCCATCAGGATGTGCGCTACTACTTAAACGGTATGCTGTTTGAAACGGAAGGTAGCGAACTGCGCACTGTCGCGACCGACGGCCACCGCCTGGCGGTGTGCTCAATGCCGCTGGAAGCGTCTTTACCCAGCCACTCGGTGATTGTGCCGCGTAAAGGCGTGATTGAACTGATGCGTATGCTCGACGGCGGCGAAAACCCGCTGCGCGTGCAGD.3hemD基因GCGACACTGACGGAAAACGATCTGGTTTTTGCCCTTTCACAGCACGCCGTCGCCTTTGCTCACGCCCAGCTCCAGCGGGATGGCCGAAACTGGCCTGCGTCGCCGCGCTATTTCGCGATTGGCCGCACCACGGCGCTCGCCCTTCATACCGTTAGCGGGTTCGATATTCGTTATCCATTGGATCGGGAAATCAGCGAAGCCTTGCTACAATTACCTGAATTACAAAATATTGCGGGCAAACGCGCGCTGATTTTGCAATGGCGGCCGCGAACTGCTGGGCGAAACCCTGACAGCTCGCGGAGCCGAAGTCAGTTTTTGTGAATGTTATCAACGATGTGCGAAAATTGCGGGATGTCAGAACGTGGITCTGTGCTCGCCGCCGCCCATCGCTGATGAAATCCTCTATGCGGCGCAACTGTGTGGCGTGCAGGAAATCTTTAACGTCGGCGGCGCGCAGGCGATTGCCGCTCTGGCCTTCGGCAGCGAGTCCGTACCGAAAGTGGATAAAATTTTTGGCCCCGGCAACGCCTTTGTAACCGAAGCCAAACGTCAGGTCAGCCAACGCCTCGACGGCGCGGCTATCGATATGCCAGCCGGGCCGGB/T40049—2021TCTGAAGTACTGGTGATCGCCGACAGCGGCGCAACACCGGATTTCGTCGCTTCTGACCTGCTCTCCCAGGCTGAGCACGGTCCGGATTCGCAGGTGATTCTGCTGACGCCTGATGCTGACATTGCCTGCAAGGTGGCGGAGGCGGTAGAACGGGCCCTGAGCGCCAGTCGTCTGATTGTGACCAAAGATTTAGCGCAGTGCGTCD.4.2hisD14ATTGCGGGATGTCAGAACGTGGTTCTGTGCTCGCCGCCGCCCATCGCTGATGAAATCCTCTATGCGGCACAACTGTGTGGCGTGCAGGAAATCTTTAACGTCGGCGGCGCGCAGGCGATTGCCGCTCTGGCCTTCGGCAGCGAGTCCGTACCGAAAGTGGATAAAATTTTTGGCCCCGGCAACGCCTTTGTAACCGAAGCCAAACGTCAGGTCAGCCAGCGTCTCGACGGCGCGGCTATCGATATGCCAGCCGGGCCGTCTGAAGTACTGGTGATCGCAGACAGCGGCGCAACACCGGATTTCGTCGCTTCTGACCTGCTCTCCCAGGCTGAGCACGGCCCGGATTCCCAGGTGATCCTGCTGACGCCTGATGCTGACATTGCCCGCAAGGTGGCGGAGGCGGTAGAACGTCAACTGGCGGAACTGCCGCGCGCGGCCCTGAGCGCCAGTCGTCIGAI"TGTGACCAAAGAT"ITAGCGCAGTGCGTCD.5.1purE5AGCGACTGGGCTACCATGCAATTCGCCGCCGAAATIITTGAAATTCTGGATGTCCCGCACCATGTAGAAGTGGTTICCGCTCATCGCACCCCCGATAAACTGITCAGCI"ICGCCGAAACGGCGGAAGAGAACGGATATCAAGTGATTATTGCCGGCGCGGGCGGCGCGGCGCACCTGCCGGGAATGATTGCGGCAAAAACGCTGGTCCCGGTACTCGGCGTGCCGGTACAAAGCGCIGCGCTAAGCGGCGTGGATAGCCTCTACTCCATCGTGCAGATGCCGCGCGGCATTCCGGTGGGTACGCTGGCGATCGGTAAAGCCGGTGCCGCTAACGCCGCCCTGCTCGCCGCGCAGATTCTGGCGCAACACGACGCGGAACTGCATCAGCGCATTGCCGACD.5.2purE6AGCGACTGGGCTACCATGCAATTCGCCGCCGAAATTTTTGAAATTCTGGATGTCCCGCACCATGTAGAAGTGGTTTCCGCCCATCGCACCCCCGATAAACTGTTCAGCTTCGCCGAAACGGATATCAAGTGATTATTGCCGGCGCGGGCGGCGCGGCGCACCTGCCGGGAATGATTGCGGCAAAAACGCTGGTCCCGGTACTCGGCGTGCCGGTACAAAGCGCTGCGCTAAGCGGCGTGGATAGCCTCTACTCCATTGTGCAGATGCCGCGCGGCATTCCGGTGGGTACGCTGGCGATCGGTAAAGCCGGTGCCGCTAACGCCGCCCTGCTCGCCGCGCAGATTCTGGCGCAACACGACGCGGAACTGCATCAGCGCATIGCCGACD.6.1sucA6AAACGCTTCCTGAACGAACTGACCGCCGCTGAAGGGCTGGAACGITATCTGGGTGCCAAATTCCCGGGTGCGAAACGTTTCTCGCTCGAGGGGGGAGATGCGCTGATACCCATGCTGAAAGACGCCATGCGGGTAACAGCGGCACTCGCGAAGTGGTGCTGGGGATGGCGCACCGCGGTCGCCTGAACGTGCTGATCAACGTACTGGGTAAAAAACCGCAGGAAAGAACATCTGGGTACCGGCGACGTGAAGTATCACATGGGCTTCTCGTCAGATATCGAAACCGAAGGCGGTCTGGTTCACCTGGCGCTGGCGTTTAACCCATCGCATCTGGAAATGTGATGGGCTCCGTGCGCGCCCGTCTGGACAGACTGGACGAACCGAGCAGCAACAAAGTGTTGCCGATCACTATTCACGGCGACGCCGCGGTGACCGGCCAGGGCGTGGTTCAGD.6.2sucA192AAACGCTTCCTGAACGAACTGACCGCCGCTGAAGGGCTGGAACGTTATCTGGGTGCCAAAGGGTGCGAAACGTTTCTCGCTCGAGGGGGGAGATGCGCTGATACCCATGCTGAAAGAGATGGTTCGCCATGCGGGTAACAGCGGCACTCGCGAAGTGGTGCTGGGGATGGCGCACCGCGGTCGCCTGAACGTGCTGATCAACGTACTGGGTAAAAAACCGCAGGAAAGAACATCTGGGTACCGGCGACGTGAAGTATCACATGGGCTTCTCGTCAGATATCGAAACCGAAGGCGGTCTGGTTCACCTGGCGCTGGCGTTTAACCCATCGCACCTGGAGTGATGGGCTCCGTGCGTGCCCGTCTGGACCGACTGGACGAACCGAGCAGCAACAAAGTGTTGCCGATCACTATTCACGGCGACGCCGCGGTGACCGGCCAGGD.7thrA基因D.7.1thrA1GTGCTGGGCCGTAATGGTTCCGACTATTCCGCCGCCGTGCTGGCCGCCTGTTTACGCGCTGACTGCTGTGAAATCTGGACTGACGTCGATGGCGTGTATACCTGTGACCCGCGCCAGGTGCCGGACGCCAGACTGCTGAAATCGATGTCCTACCAGGAAGCGATGGAACTCTCTTACTTCGGCGCCAAAGTCCCACCCTCGCACCATAACGCCTATCGCCCAGTICCAGATCCCCTGTCTGAITAAAAATACCGGTAATCCGCAGGCGCCAGGAACGCTGATCGGCGCGTCCAGCGAC