(高清版)GBT 40174-2021 工具酶纯度的检测方法

ICS07.080国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40174—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG11)提出并归口。本文件起草单位：福建南生科技有限公司、夏禾(深圳)生物技术有限公司、苏州坤琪生物科技有限公司、上海鹰姿生命科技有限公司、雷谷(厦门)生物医药有限公司、福建华灿制药有限公司、厦门大学、因科技有限公司。GB/T40174—2021工具酶纯度的检测方法1范围本文件适用于工具酶纯度的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法YY/T0087电泳装置3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。工具酶纯度purityofreagentenzymes目标工具酶在样品总蛋白质或固含物中所占的质量百分比。样品经福林酚法测定出每毫克或每毫升样品中的蛋白质所占的质量。样品烘干后获得的无水固体物质在每毫克或每毫升样品中所占的质量。4原理用牛血清白蛋白标准品作对照，对样品经十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳后的胶带进行扫面，再进行灰度值计算，获得样品中目标工具酶的质量，再采用福林酚法测定样品总蛋白质的质量或用炽灼残渣检查法测定样品固含物含量，从而计算出工具酶纯度。5试剂或材料除非另有规定，所用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。5.1碱性铜溶液称取氢氧化钠10g,碳酸钠50g,加水400mL使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g,加水50mL使—2GB/T40174—2021称取钨酸钠100g、钼酸钠25g,加水700mL、85%磷酸50mL与盐酸100mL,置磨口圆底烧瓶5.430%丙烯酰胺溶液-0.8%N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(Acr-Bis)溶液瓶，宜4℃避光保存。5.50.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCI)缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g,加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8,加水定容至100mL,宜5.61.5mol/L的Tris-HCI缓冲液保存。5.810%过硫酸铵溶液称取三羟甲基氨基甲烷0.152g、溴酚蓝1mg、SDS0.4g,甘油2mL,用盐酸调pH值至6.8,加水溶解并稀释至10mL。该缓冲液用于非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。如用于还原型SDS-聚丙烯稀释至1000mL。称取三氯醋酸5g,加水200mL溶解后，加甲醇200mL,再加水定容至500mL。称取1.0g考马斯亮蓝R250,加入甲醇200mL、冰醋酸50mL,加水定容至250mL,混匀。3GB/T40174—20215.13脱色液取甲醇400mL、冰醋酸100mL,加水定容至1000mL,混匀。6仪器设备6.1紫外-可见分光光度计。6.2电泳装置，应符合YY/T0087的要求。6.3凝胶薄层扫描仪。6.4电子分析天平，分度值为0.0001g。7样品制备准确称取样品W₁(若样品为液体时，准确量取),用合适的溶液溶解制成1mg/mL的样品溶液，按照附录A的方法测得样品中蛋白质含量Cy。8试验步骤8.1电泳样品缓冲液，100℃煮沸3min,按照附录B的方法进行电泳。8.2扫描取脱色好的胶片，置凝胶薄层扫描仪中，分别对样品和牛血清白蛋白电泳胶带进行扫描。8.3标准曲线的绘制用软件计算牛血清、白蛋白电泳胶带灰度值，以灰度值为横坐标，蛋白质含量为纵坐标，绘制标准曲线，见公式(1): (1)式中：W——蛋白质的质量，单位为毫克(mg);H——灰度值；9结果计算9.1样品中目标工具酶质量的计算用软件计算样品中目标工具酶电泳胶带的灰度值，代入公式(1),计算出上样样品中目标工具酶的质量(W₂)。样品中目标工具酶质量按公式(2)计算：W₃=W₂×F…………(2)4GB/T40174—2021式中：W₃——样品中目标工具酶的质量，单位为毫克(mg);W₂——上样样品中目标工具酶的质量，单位为毫克(mg);F——稀释倍数。9.2样品总蛋白质中工具酶纯度的计算样品总蛋白质中工具酶纯度按公式(3)计算：式中：Cp——样品总蛋白质中工具酶纯度；W₃———样品中目标工具酶的质量，单位为毫克(mg);W₁——样品质量或体积，单位为毫克(mg)或毫升(mL);C,——样品中的蛋白质含量，单位为毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/mL)。9.3样品固含物中工具酶纯度的计算样品固含物中工具酶的纯度按公式(4)计算：式中：C、——样品固含物中工具酶纯度；W₃———样品中目标工具酶的质量，单位为毫克(mg);W₁——样品质量或体积，单位为毫克(mg)或毫升(mL);Ca———样品中的固含物含量，单位为毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/mL)。10质量控制在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算数平均值5GB/T40174—2021(规范性)福林酚法测定蛋白质含量A.1原理依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu²+螯合形成蛋白质-铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质的浓度呈正比，以蛋白质标准溶液作标准曲线，计算出样品中蛋白质的含量。A.2试验步骤A.2.1牛血清白蛋白标准溶液的配制准确称取适量的牛血清白蛋白标准品，加水溶解并制成0.2mg/mL的标准溶液。A.2.2标准曲线的绘制准确量取标准溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL,分别置于具塞试管中，加水至1.0mL,再分别加入碱性铜溶液(5.1)1.0mL,摇匀，室温放置10min后，分别加入福林酚溶液(5.2)4.0mL,立即混匀，室温放置30min后，在650nm的波长处测定吸光度。以标准溶液浓度与其相对应的吸光度绘制标准曲线，回归方程见公式(A.1):C=bX+a…………(A.1)式中：C——蛋白质含量，单位为毫克每毫升(mg/mL);X——在650nm的波长处测定吸光值；b——斜率。A.2.3样品测定将第7章中制备得到的样品溶液用水稀释为0.1mg/mL的试样溶液，准确量取试样溶液适量，按A.2.2的操作进行测定。从标准曲线计算出每毫升测定样品溶液中的蛋白质含量。A.3结果计算按照A.2.3测出样品溶液的吸光值，再将吸光值代入公式(A.1),计算出每毫升测定样品溶液中的蛋白质含量(C₁)。样品中的蛋白质含量(Cy),按公式(A.2)计算：式中：…………(A.2)Cy———样品中的蛋白质含量，单位为毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/mL);C₁———每毫升测定样品溶液中的蛋白质含量，单位为毫克每毫升(mg/mL);V——测定样品溶液的体积，单位为毫升(mL);F———稀释倍数；6GB/T40174—2021(规范性)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳B.1原理依据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂SDS按质量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按相对分子质量大小进行分离。B.2试验步骤B.2.1分离胶溶液的制备根据不同相对分子质量的需要，按表B.1制成分离胶溶液，灌入模具内至一定高加水封顶，室温下聚合。表B.1分离胶和浓缩胶配制比例凝胶种类分离胶浓缩胶凝胶浓度试液体积/mL1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)—0.5mol/LTris-HCl(pH6.8)0.63水8.454.70.150.150.150.150.150.150.0510%过硫酸胺0.150.150.150.150.150.150.05四甲基乙二胺(TEMED)0.0060.0060.0060.0060.0060.0060.005注：“—”为空白。B.2.2浓缩胶溶液的制备待分离胶溶液聚