(高清版)GBT 40268-2021 免疫磁性材料性能检测方法

国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40268—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。本文件起草单位：北京市理化分析测试中心、中国检验检疫科学研究院、深圳市易瑞生物技术股份管理技术中心。GB/T40268—2021体或抗原等生物活性分子，可以与目标物特异性结合。本文件包含了材料学、磁学和生物学等专业的内容和分析技术。本文件涉及的免疫磁性材料主要应用于生物医药、食品安全、体外诊断等领域的分离、纯化和检测等过程。本文件提出了免疫磁性材料基本性能的各项指标，确定了检测该材料性能的方法。主要指标包括性和捕获率稳定性。1GB/T40268—2021免疫磁性材料性能检测方法本文件适用于50nm～100μm粒径范围内，具有超顺磁性且表面固定有抗体或抗原等生物活性分子的复合材料的性能检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T13888在开磁路中测量磁性材料矫顽力的方法GB/T15445.6粒度分析结果的表述第6部分：颗粒形状和形态的定性及定量表述GB/T19077粒度分析激光衍射法GB/T21649.1粒度分析图像分析法第1部分：静态图像分析法GB/Z26082纳米材料直流磁化率(磁矩)测量方法GB/T29022粒度分析动态光散射法(DLS)GB/T38431颗粒分散体系稳定性评价静态多重光散射法3术语和定义3.1表面固定有抗体或抗原等生物活性分子，在一定条件下能够与目标物特异性结合的一类具有超顺磁性的复合材料。3.2免疫磁性材料在分散体系中分散状态随时间发生的变化。3.3小于临界尺寸具有单畴结构的铁磁物质的磁化性质。注：当温度低于居里温度高于转变温度时表现为顺磁性特点，但在外磁场作用下其顺磁性磁化率远高于一般顺磁3.4在给定温度下免疫磁性材料所能达到的磁化强度最大值。2GB/T40268—20213.5矫顽力coercivity通过单调降低外加磁场强度，免疫磁性材料的磁化强度从磁饱和状态值降为零时，其矫顽磁场3.6磁回收率recoveryrateofmagneticmaterials在一定的捕获体系中，免疫磁性材料均匀分散后，在磁场作用下分离回收得到的量与原体系中总量的百分比。3.7单位质量的免疫磁性材料捕获目标物时，随着捕获体系中目标物增加，磁分离获得的目标物不再增加时所得到的目标物结合量。3.8在一定的捕获体系中加入一定量的目标物，经过免疫磁性材料结合并分离到的目标物与原体系中目标物总量的百分比。3.9捕获特异性capturespecificity3.10捕获率稳定性stabilityofcaptureefficiency免疫磁性材料在一定的储存条件下或一定的捕获体系内，保持原捕获率的能力。4一般要求4.1试剂除非有特殊说明，所用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。磷酸二氢钾溶于1L水中。亦可根据免疫磁性材料的使用要求确定。4.2设备4.2.2磁力架(磁分选器):根据免疫磁性材料的使用要求确定，磁感应强度不小于0.3T。4.3样品的准备进行各项性能检测时，应将待测免疫磁性材料样品用涡旋混合器振荡30s以上，均匀分散后，立即吸取相应体积进行各项性能检测。5质量浓度5.1检测原理在真空2.67kPa(20mmHg)条件下，水的沸点降低至21℃左右，免疫磁性材料在56℃能快速干3GB/T40268—2021燥，且干燥过程中该材料不发生质量变化，以干燥至恒重时的称量值作为该材料的质量来计算质量浓度。5.2仪器设备和器具5.2.1天平：感量0.1mg。5.2.2真空干燥箱：温度精度±1℃,压力能保持在2.67kPa(20mmHg)以下。5.2.3玻璃称量瓶：规格35mm×25mm。5.2.4干燥器：内附有效干燥剂。5.3试验步骤和结果计算准确吸取一定体积(Va,0.5mL～5.0mL)的免疫磁性材料样品，用缓冲液清洗该材料两次，加入到已烘干至恒重的玻璃称量瓶(mw)中；置于磁力架上，将该材料磁分离，待上清液澄清后弃去上清，磁分离后该材料湿重需达到30mg～150mg。然后将装有该材料的称量瓶放置于真空干燥箱中，玻璃称量瓶盖子稍微错开与试样同时干燥，温度设置为56℃±1℃,压力应保持在2.67kPa(20mmHg)以下，干燥约1h,将玻璃称量瓶和盖子迅速移至干燥器中冷却，冷却15min后盖好盖子，称重，精确至0.1mg。然后再次放入真空干燥箱中干燥约30min,之后冷却，称重，重复以上操作至恒重(ma)。免疫磁性材料样品的质量浓度按式(1)计算： (1)式中：Po——免疫磁性材料样品的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL);md———免疫磁性材料样品置于称量瓶中烘干至恒重的质量，单位为毫克(mg);mw——烘干至恒重的称量瓶质量，单位为毫克(mg);Vd——吸取的免疫磁性材料样品的体积，单位为毫升(mL)。计算出3次平行测定结果的算术平均值和标准偏差，结果精确至0.1mg/mL。注：恒重为进行重复干燥后，连续两次称量值之差不大于0.3mg。6粒度6.1光学分析法微米级材料按GB/T19077的要求执行；纳米级或亚微米级材料按GB/T29022的要求执行。6.2显微图像法本方法适用于粒径范围小于10:1的窄分布的免疫磁性材料样品，按GB/T21649.1的要求执行。按GB/T15445.6的要求对表面形貌进行描述，并附照片。如光学分析法测量出的平均粒径(D)和显微图像法测量出的平均粒径(d)差距较大，可按式(2)计算团聚指数(T):…………(2)式中：D———光学分析法测量出的平均粒径，单位为纳米(nm);4GB/T40268—2021d——显微图像法测量出的平均粒径，单位为纳米(nm)。7分散稳定性用缓冲液将免疫磁性材料稀释至使用浓度(一般为0.05mg/mL～50mg/mL),按GB/T38431的要求执行，得到不稳定性指数和迁移速度随时间的变化关系曲线；或计算出一段时间内(一般为5min~30min,根据此样品使用要求确定)不稳定性指数和迁移速度。计算出3次平行测定结果的算术平均值，不稳定性指数保留两位有效数字，迁移速度保留至1mm/h。8超顺磁性制磁化曲线和磁滞回线(进一步的操作细节参照JY/T0591.1—2020),得到饱和磁化强度；按GB/T138889磁回收率9.1检测原理根据比尔定律，免疫磁性材料样品的吸光度与该材料的浓度呈正比，通过测量免疫磁性材料样品的吸光度以及经过磁分离回收得到的材料在相同缓冲液中重悬后的吸光度，计算磁分离后该材料浓度与磁分离前浓度的比值，即可得到磁回收率。9.2仪器设备和器具9.2.1分光光度计：波长范围360nm～800nm。9.2.3离心管。9.3试剂料的使用要求确定种类和体积。9.4试验步骤和结果计算9.4.1确定测试波长缓冲液稀释免疫磁性材料样品至0.1mg/mL～0.5mg/mL,涡旋振荡，使均匀分散，加入比色皿中，通过可见光分光光度计进行全光谱波长扫描，选择最大吸光度所对应的波长为测试波长。调整样品浓度使其在测试波长下的吸光度落在0.3～0.8之间，此浓度记为pa,对浓度为p。的样品按表1进行稀释，将稀释后的5个样品振荡混匀，分别在测试波长下检测吸光度，建立磁回收率与吸光度之间的标准曲线，线性相关系数R应不低于0.99。5GB/T40268—2021表1稀释样品的制备及其吸光度值对应的磁回收率浓度为p。样品与缓冲液比例磁回收率%将浓度为pa的样品转移至离心管置于磁力架中进行磁分离，3min左右至溶液变澄清，弃去上清根据此样品使用要求确定)至磁分离测试液变澄清，弃去测试液。用缓冲液清洗该样品材料2次以上，再加入与弃去上清液相同体积的缓冲液，涡旋振荡，重悬，再次测定吸光度。进行3次平行试验，3个吸光度的相对标准偏差允许5%以内，计算平均值，通过上述建立的标准曲线计算磁回收率(Pm)。结果保留两位有效数字。10目标物饱和结合量在一定条件下，免疫磁性材料特异性结合目标物，并在一定磁场下将目标物分离出来，通过目标物的回收率来表示该材料的捕获率；随着目标物浓度的增加，当其结合目标物达到饱和后捕获率会显著下降，此时以该材料结合目标物的量作为目标物饱和结合量。目标物溶液：目标物标准品用缓冲液稀释制备一系列浓度梯度的目标物溶液。注：目标物为细胞或微生物时，目标物溶液由标准细胞系或标准菌株纯培养取得。10.3.2离心管。离心管中加入一定体积(V₁,一般为0.1mL～1mL,根据使用要求确定)不同浓度(p:,i=1…n)的目标物溶液(最小的目标物浓度p₁宜比该目标物检测方法的定量限大2个数量级),再分别加入一定体积(V₀,一般为0.01mL～0.1mL)的免疫磁性材料。然后进行免疫磁分离试验：在适宜的温度下(一般为室温，根据使用要求确定)混匀一段时间(一般为10min～60min,根据使用要求确定),将离心管置于磁力架中进行磁分离，3min左右(根据使用要求确定)至溶液变澄清，取上清液检测目标物的浓度(p₅,s=1…n)。6目标物浓度的测定根据目标物种类的不同，参照的标准方法也不同。三大类别的目标物分别按照以下方法进行测定：a)目标物为药物、毒素、激素、抗体、细胞因子等化合物时，按照相应的分析化学或免疫学等方法进行浓度的测定，如黄曲霉毒素B1参照GB/T36858—2018,单位为微克每毫升(μg/mL);b)目标物为细胞时，按照流式细胞仪或血球计数法进行细胞密度的测定，如CD4+T细胞参照GB/T38506—2020,单位为个每毫升(cells/mL);c)目标物为微生物时，按照平板培养法进行微生物浓度的测定，如沙门氏菌按照GB4789.2—2016,单位为菌落形成单位每毫升(CFU/mL)。10.5结果计算目标物浓度为p;时的捕获率按式(3)计算：………………式中：CE;——目标物浓度为pi时的捕获率；Ps——磁分离后上清液目标物的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)或个每毫升(cells/mL或CFU/mL);V₀--——免疫磁性材料的体积，单位为毫升(mL);V₁-—目标物溶液的体积，单位为毫升(mL);p;——目标物的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)或个每毫升(cells/mL或CFU/mL)。结果取3次平行试验的算术平均值(3个结果的相对标准偏差允许5%以内),结果保留两位有效数字。………………式中：w———单位质量免疫磁性材料的目标物饱和结合量，单位为微克每毫克(μg/mg)或个每毫克(cells/mg或CFU/mg);Pi-1——免疫磁性材料饱和前目标物的浓度(pi-1<pi),单位为微克每毫升(μg/mL)或个每毫升(cells/mL或CFU/mL);CEi-1-——目标物浓度为pi-1时的捕获率；V₁--—目标物溶液的体积，单位为毫升(mL);p₀--——免疫磁性材料样品的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL);V₀——免疫磁性材料的体积，单位为毫升(mL)。结果保留两位有效数字。11目标物捕获率11.1检测原理免疫磁性材料对中等浓度目标物的回收率为目标物捕获率。11.2仪器设备和器具同10.3。7GB/T40268—202111.3试验步骤和结果计算11.3.1制备中等浓度的目标物溶液中等浓度为免疫磁分离试验中最小的目标物浓度与饱和结合时目标物浓度的几何平均值所处的浓度水平，按式(5)计算：Pm=√P₁×Pi-1…………(5)式中：Pm——中等浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)或个每毫升(cells/mL或CFU/mL);p₁——最小的目标物浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)或个每毫升(cells/mL或CFU/mL);Pi-1——目标物饱和结合量检测中材料样品达到饱和时目标物的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)或个每毫升(cells/mL或CFU/mL)。根据中等浓度的计算结果，用缓冲液制备目标物溶液。当测试液(见9.3)中目标物浓度可按照标准方法进行定量检测时，也可用测试液代替缓冲液制备中等浓度的目标物溶液。11.3.2捕获率的测定按10.4的步骤进行免疫磁分离试验，并按式(3)计算目标物捕获率(CEm)。12捕获特异性12.1检测原理免疫磁性材料的特异性体现为对等量目标物和非目标物捕获率的比值。12.2.1中等浓度的目标物溶液：同11.3.1。12.2.2中等浓度的非目标物溶液：非目标物标准品用缓冲液稀释至与目标物溶液相同浓度。12.3仪器设备和器具同10.3。12.4试验步骤和结果计算按10.4的步骤进行免疫磁分离试验，并按式(3)计算免疫磁性材料对目标物捕获率(CEm)和非目标物捕获率(CEa),然后按式(6)计算捕获特异性：式中：S——捕获特异性；CE。—免疫磁性材料对非目标物捕获率；CEm———免疫磁性材料对目标物捕获率。结果保留两位有效数字。8GB/T40268—202113