《水环境监测》课件-学习情景42 总大肠菌群的测定

室内环境检测与控制技术专业资源库ProfessionalResourceBaseofIndoorEnvironmentalInspectionandControlTechnology总大肠菌群的测定——多管发酵法一

预备知识总大肠菌群是指那些能37℃48h之内发酵乳糖产酸产气的、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽孢杆菌。主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。粪便中存在有大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的抵抗力等与肠道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌等相似，因此将总大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌是合适的。但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，这是不利之处。一

预备知识总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可适用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，需要时间较长；滤膜法主要适用于杂质较少的水样，操作简单快速。多管发酵法是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。一

预备知识多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示试验结果的。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显阳性又显阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。二实训准备准备事宜名称方法样品的采集和保存

水样采集在经灭菌的玻璃瓶内，要尽快分析，一般不宜超过2h，否则应4℃保存，可保存12h。准备事宜名称方法实训试剂水蒸馏水或纯水。乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，乳糖5g，氯化钠5g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水1000ml。制法：将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。二实训准备准备事宜名称方法

实训试剂

三倍乳糖蛋白胨培养液按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。伊红美蓝培养基成分：蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾（K2HPO42.0g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，2%伊红水溶液20ml，0.5%美蓝水溶液13ml。制法：①贮备培养基：先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热融化，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整pH为7.2~7.4。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min。贮存于冷暗处备用。②平板培养基：将贮备培养基加热融化。以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及0.5%美蓝水溶液加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。当混合好的培养基冷至45℃，便立即适量倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。二实训准备三分析步骤生活饮用水饮用水源水和较清洁的地表水严重污染的地表水和废水在二个装有已灭菌的50ml三倍乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100ml将水样作1︰10稀释于各装有5ml三倍乳糖蛋白胨培养液的五个试管中（内有倒管），各加10ml水样初发酵试验的接种水样应作1︰10，1︰100，1︰1000或更高的稀释在10支装有已灭菌的5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作各加入充分混匀的水样10ml于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的10个试管中（内有倒管），其中5管各加入1ml水样，另5管各加入1ml1︰10稀释的水样于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的15个试管中（内有倒管），其中5管各加入1ml1︰10稀释的水样，5管各加入1ml1︰100稀释的水样，5管各加入1ml1︰100稀释的水样初发酵试验三分析步骤各管（瓶）混匀后置于37℃恒温箱培养24h经初发酵试验培养24h后，将产酸产气及只产酸发酵试管，分别用接种环划线接种于伊红美蓝培养基上置37℃恒温箱内培养18~24h挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。①深紫黑色，具有金属光泽的菌落；②紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡紫红色，中心色较深的菌落。平板分离三分析步骤涂片镜检菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，挑选该菌落另一部分接种于普通浓度蛋白胨培养液中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1~3个。置于37℃恒温箱中培养24h。有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。根据阳性管（瓶）数，按粪大肠菌群的方法报告每升水样中总大肠菌群数。复发酵试验三分析步骤样品编号接种水量（ml）初发酵时水样呈阳性数复发酵时水样呈阳性数MPN值（个/100ml）总大肠菌群（个/L）备注

分析人

校对人