冷冻电子显微镜中的低温样品制备

1/1冷冻电子显微镜中的低温样品制备第一部分冷冻样品的制备技术 2第二部分常用冷冻固定方法 4第三部分样品玻璃化的原理与方法 6第四部分低温条件下样品的保存和运输 8第五部分低温样品的切片技术 11第六部分样品载体的选择和优化 14第七部分低温下样品的三维重建 16第八部分低温样品制备的质量控制 18

第一部分冷冻样品的制备技术关键词关键要点主题名称：冷冻固定

1.低温固定法应用于封存生物样品的瞬时状态，以尽量减小冰晶形成对样品结构的影响。

2.常用方法包括高压冷冻固定、低温化学固定和超快冷冻固定，选择取决于样品类型和所需分辨率。

3.高压冷冻固定是最常见的技术，能够将样品在毫秒内冷冻，显著减少冰晶形成。

主题名称：冷冻替代

冷冻样品的制备技术

在冷冻电子显微镜（cryo-EM）中，快速制备冷冻样品至关重要，以最大程度地减少冰晶形成和水分丢失。常用的冷冻样品制备技术包括：

1.玻璃化冷冻

玻璃化冷冻涉及将样品快速冷却至液氮温度（-196°C）或以下，以形成玻璃态，避免冰晶形成。通常采用两种方法：

*静态玻璃化：将样品悬浮在网格上，然后快速浸入液氦或液氮中。

*动态玻璃化：将样品与玻璃化剂混合，然后通过快速施加压力（例如使用冷冻机或高压冷冻机）将其强制冷却。

2.水合化玻璃化

水合化玻璃化是一种玻璃化变体，其中样品中保留了水分。通过将样品悬浮在玻璃化剂和水的混合物中来实现。这种方法可用于分析具有水合抑制剂或其他与水相互作用分子的样品。

3.低温水合化负染

低温水合化负染是一种将污渍应用于冷冻水合样品的技术。污渍可以增强样品的对比度，而低温条件可以防止污渍溶解或破坏样品。

4.单粒子冷冻负染（SPINE）

SPINE是一种高通量方法，用于从冷冻样品中收集单粒子图像。它涉及将样品快速冷冻，然后将其浸入负染剂中，以增加单个分子的对比度。

5.丝束冷冻（FRET）

丝束冷冻涉及将样品悬浮在网格上，然后快速冷冻，以形成细长的冰丝束。该技术可用于研究样品的结构和动态性。

6.冷冻替代

冷冻替代是一种替代玻璃化的技术，涉及在低温下用有机溶剂逐步替换样品中的水。该方法可减少冰晶形成，但可能导致样品脱水。

冷冻样品制备的优化

冷冻样品制备的优化对于获得高质量的cryo-EM图像至关重要。需要考虑以下因素：

*样品悬浮液浓度：最佳浓度取决于样品的类型和大小。

*玻璃化剂选择：不同的玻璃化剂具有不同的特性，可能更适合某些样品。

*样品厚度：样品应足够薄，以允许电子束穿透。

*冷冻速度：快速冷冻可以减少冰晶的形成。

*负染条件：污渍的类型和浓度应优化以获得最佳对比度。

通过仔细优化这些参数，可以制备出适合cryo-EM分析的优质冷冻样品。第二部分常用冷冻固定方法关键词关键要点【冷冻固定：快速冷冻法】

1.利用液氮或液体氦等极低温液体，快速将样品冷冻至-196°C或以下，在几毫秒内形成非晶态冰。

2.样品中的水分迅速玻璃化，形成无序的、高密度状态，限制了冰晶的生长和对样品结构的破坏。

3.该方法适用于体积较小的样品，因为它需要快速、高效的热传递。

【冷冻固定：高压冷冻法】

常用冷冻固定方法

低温电子显微镜（cryo-EM）中的冷冻固定是保留生物样品结构和分子组分的关键步骤。常用冷冻固定方法包括：

#高压冷冻

高压冷冻（HPF）是一种快速冷冻样品的方法，以避免冷冻过程中的冰晶形成。此方法将样品置于高压（约21000个大气压）下，然后迅速冷却至约-196℃，从而将水非晶态化。HPF可很好地保留膜蛋白复合物和其他对冰敏感的结构。

#冻结替代法

冻结替代法（FS）涉及在低温下用有机溶剂逐步取代样品中的水。此方法包括以下步骤：

-固定：用化学固定剂（如戊二醛或甲醛）固定样品。

-脱水：将样品浸入乙醇梯度中，逐渐脱水。

-渗透：用过渡溶剂（如丙酮、四氢呋喃或双氧六环）渗透样品，置换乙醇。

-嵌入：用树脂（如LR白或Epoxy）包埋样品，填充剩余的孔隙。

-聚合：加热树脂，进行聚合。

FS产生的树脂包埋样品具有更高的机械稳定性，可用于长期的室温储存和精细切片。

#常规玻璃化

常规玻璃化是一种简单且广泛使用的冷冻固定方法，涉及将样品混合到玻璃形成剂溶液中，然后快速冷冻至玻璃化转变温度（Tg）以下。玻璃形成剂（如戊二醇或甘油）可降低水的冰点，从而防止冰晶形成。此方法适用于非膜蛋白复合物和其他对冷冻敏感性较低的结构。

#微流控玻璃化

微流控玻璃化是一种先进的玻璃化技术，利用微流控装置精确控制玻璃化条件。此方法涉及将样品与玻璃形成剂溶液混合，然后通过狭窄的微流控通道输送。微流控装置提供均匀的冷却速率和低剪切力，可减少非特异性聚集和冷冻损伤。

#超快速冷冻

超快速冷冻（UFF）是一种极快的冷却技术，可将样品冷却至极低温（约-130℃）以下，从而减少冰晶形成的机会。UFF使用液体氮或氦气喷射，将样品直接喷射到冷冻板上。此方法适用于冷冻敏感的样品，如水合膜蛋白和核酸复合物。

#选择冷冻固定方法

最佳冷冻固定方法取决于待研究的样品类型和预期用途。对于膜蛋白复合物和其他对冷冻敏感的结构，HPF或FS是首选方法。对于非膜蛋白复合物和对冷冻敏感性较低的结构，常规玻璃化或微流控玻璃化可能是合适的。UFF适用于极度冷冻敏感的样品。

冷冻固定后的样品可以存储在液氮中或使用冷冻电子显微镜进行观察。第三部分样品玻璃化的原理与方法关键词关键要点主题名称：玻璃化的原理

1.玻璃化是一种非晶态的固体状态，其原子或分子排列无序，类似于液体的结构，但又具有固体的性质。

2.在冷冻过程中，玻璃化是指通过快速冷却将液体转化为玻璃态，从而避免晶体的形成。

3.玻璃化的成功取决于冷却速率和样品的性质，通常需要达到10^3-10^6K/s以上的冷却速率。

主题名称：玻璃化样品制备方法

样品玻璃化的原理

玻璃化是一种非晶态固化的过程，涉及使液体快速冷却至低于其玻璃化转变温度（Tg）而不形成晶体。在电子显微镜样品制备中，玻璃化通过将液态样品快速冷冻至极低温来实现，使其形成固态玻璃，保持其纳米结构的流动性和生物活性。

玻璃化的两种方法

1.冻结包埋（嵌入）

*样品悬浮在缓冲液中，并与高浓度的冷冻保护剂（如甘油、乙二醇）混合。

*样品被快速冷冻至极低温（通常低于-150°C），导致冷冻保护剂形成玻璃基质，将样品包埋。

2.冷冻干燥悬滴

*样品悬浮在缓冲液中，并悬滴在诸如金网格或碳基支持物等载体上。

*样品被快速冷冻至极低温，导致水迅速升华，留下干玻璃化的样品。

玻璃化参数

影响玻璃化的关键参数包括：

*冷冻速率：快速冷冻（通常在10,000°C/s以上）可抑制晶体形成，促进玻璃化。

*冷冻保护剂浓度：高浓度的冷冻保护剂可降低水的冰点并抑制晶体生长。

*样品厚度：较薄的样品可更快冷冻，从而提高玻璃化效率。

*缓冲液离子强度：高离子强度可抑制电荷相互作用，改善玻璃化。

*样品组成：不同样品（如蛋白质、脂质）对玻璃化的敏感性不同。

玻璃化验证

冻结后的样品可以通过以下方法验证其玻璃化状态：

*差示扫描量热法（DSC）：玻璃化样品不会表现出明显的熔化峰。

*电子衍射：玻璃化的样品呈现模糊的衍射环，而不是晶体的清晰斑点。

*冷场发射扫描电子显微镜（cryo-SEM）：玻璃化的样品显示出平滑均匀的表面，没有晶体结构。

玻璃化的应用

玻璃化技术在冷冻电子显微镜中广泛应用于：

*保存生物大分子（如蛋白质、核酸）的非晶态结构，以进行结构分析。

*研究细胞和组织的冷冻固定保存，以保留其原生状态。

*开发药物靶标的冷冻固定结构，以指导药物设计和发现。第四部分低温条件下样品的保存和运输关键词关键要点低温条件下样品保存

1.冷冻样品耐受极低温度的能力vary，取决于样品组成、冷冻前制备方法和冷冻速率。

2.细胞器和生物分子的冰点不同，冷冻过程中微小细胞器可能形成冰晶，破坏细胞结构。

3.缓慢的冷冻速率允许冰晶形成和生长，损害样品;而超快冷冻法可显著减少冰晶形成。

样品冷冻方法

1.缓慢冷冻方法（-1℃/min）适用于对冰晶敏感的样品，如组织块。

2.快速冷冻方法（-50℃/min）适用于对冰晶不敏感的样品，如病毒颗粒。

3.超快速冷冻方法（-10,000℃/min）利用液体乙烷等冰晶抑制剂，最大程度地减少冰晶形成。

冷冻样品的储存

1.冷冻样品应储存在液氮（-196℃）或液氦（-269℃）中，以保持其冰冻状态。

2.长期储存应使用液氦，因为它比液氮具有更低的沸点，从而提供更稳定的储存条件。

3.储存容器的选择取决于样品大小和形状，以及储存持续时间。

冷冻样品的解冻

1.解冻样品的方式应与冷冻方式一致，快速解冻可最大程度地减少样品损坏。

2.缓慢解冻方法适用于组织块等对冰晶敏感的样品，应在冰箱中以1℃/min的速度解冻。

3.快速解冻方法适用于对冰晶不敏感的样品，如核酸和蛋白质，可以使用微波炉或水浴快速解冻。

低温条件下样品的运输

1.运输冷冻样品需要使用干冰或液氮作为冷冻剂，以维持低温条件。

2.运输过程应尽可能缩短，并使用绝缘运输容器以防止样品变暖。

3.样品应事先进行适当的冷冻处理，以最大程度地提高耐受运输条件的能力。

未来趋势

1.微流体技术的进步可用于改进冷冻速率和控制，从而提高样品质量。

2.隐形冷冻技术开发瞄准减少冰晶形成，从而进一步提高样品保存和观察。

3.机器学习在冷冻电子显微镜中的应用可帮助优化冷冻样品制备过程，以取得更好的成像结果。低温条件下样品的保存和运输

在冷冻电子显微镜（Cryo-EM）实验中，样品制备是一个关键步骤，其中低温条件下的保存和运输至关重要。低温样品的妥善处理可确保其结构完整性，并在显微镜分析中获得高分辨率图像。

保存低温样品

*液氮冷冻：这是保存低温样品的常用方法。样品被迅速冷冻到液氮温度（-196°C），然后保存在液氮罐中。液氮冷冻可使样品长期保持在非晶态，并防止冰晶形成。

*玻璃化：玻璃化涉及将样品中的水与玻璃化剂（如蔗糖、海藻糖）混合，然后快速冷冻。这种方法可防止冰晶形成，并保持样品的结构完整性。

*高温超导制冷：高温超导制冷使用超导电磁体产生低温环境（-150°C左右）。这是一种相对较新的方法，可提供比液氮冷冻更稳定的低温条件。

运输低温样品

运输低温样品需要专门的设备和程序，以确保样品的结构完整性。

*干冰运输：干冰（固态二氧化碳）可提供约-78°C的温度。它通常用于运输小体积样品，运输时间较短。

*液氮运输：液氮可提供-196°C的温度，适用于运输大体积样品和需要长期运输的情况。液氮运输罐采用真空绝缘，可以长时间保持样品低温。

*低温冷藏箱：低温冷藏箱使用机械制冷系统，可以精确控制温度（-80°C至-150°C）。它们适用于运输需要更稳定低温条件的样品。

运输过程中样品保护措施

*保温：使用保温箱或其他绝缘材料包裹样品容器，以防止温度波动。

*冷剂：在样品容器周围放置冷剂（如干冰或液氮），以保持低温。

*监测：使用温度计或数据记录器监测样品的温度，以确保其保持在适当的范围内。

*避免振动：轻柔地处理样品，避免振动或冲击，以免损坏样品。

运输时间和距离限制

运输低温样品的距离和时间限制取决于所使用的运输方法和样品的稳定性。

*干冰运输：通常适用于短途运输（几个小时），距离限制在500公里以内。

*液氮运输：适用于长途运输，距离限制取决于液氮容器的保冷时间。

*低温冷藏箱：提供最长时间的保冷时间，适用于长途运输和需要稳定低温条件的样品。

通过采用适当的保存和运输方法并遵守以上准则，可以在低温条件下保持样品的结构完整性，并确保在Cryo-EM分析中获得高质量的图像。第五部分低温样品的切片技术关键词关键要点低温样品的制备

1.快速冷冻：

-将样品迅速冷冻至液氮温度，以避免冰晶形成。

-常用方法包括高压冷冻（HPF）和低温电子喷雾（Cryo-SP）。

2.冷冻固定：

-在快速冷冻后，将样品浸入冷冻固定剂中，以稳定蛋白质结构。

-常用的冷冻固定剂包括戊二醛和锇酸。

低温样品的切片技术

3.冷冻切片：

-使用冷冻切片机，在低温下将样品切成薄片。

-常用的冷冻切片机包括冷冻超薄切片机和冷冻聚焦离子束（FIB）切片机。

4.冷冻电切片：

-使用高能电子束，在低温下切割样品。

-电切片可以产生更薄、更均匀的切片，适合高分辨率成像。

切片后处理

5.免疫金标记：

-使用金标记抗体，在切片上标记特定蛋白。

-金标记可以提高图像对比度，便于蛋白质定位。

6.对比增强：

-使用乌拉尼尔醋酸铅或柠檬酸铅，对切片进行对比增强。

-对比增强可以提高样品的电子密度，使其在图像中更容易观察。低温样品的切片技术

在冷冻电子显微镜(cryo-EM)中，低温样品的切片对于获得高质量图像至关重要。切片技术涉及将冷冻样品切成超薄切片，同时保持其结构完整性和冷冻状态。

超薄切片技术

超薄切片技术使用低温超显微切片机，该机器配备金刚石刀片和液氮冷却系统。在切割过程中，样品保持在液氮温度（-196°C）下，以防止损伤或结构改变。

最常用的超薄切片技术包括：

*垂直切片：将样品垂直于刀片边缘切割，产生横截面切片。这是cryo-EM样品中最常用的切片方法。

*倾斜切片：样品以一定角度相对于刀片边缘切割，产生斜切片。这可用于获得样品的不同取向，从而提高图像重建的质量。

切片厚度

超薄切片技术的另一个关键因素是切片厚度。理想的切片厚度在60-100纳米之间，这允许电子束穿透样品，同时保持足够的分辨率。太厚的切片会导致图像模糊，而太薄的切片可能会破裂或难以分析。

样品制备

在切片之前，需要将样品进行制备，以提高超薄切片过程的成功率。这通常涉及以下步骤：

*固定：使用戊二醛等固定剂将样品固定到位，以保持其结构。

*低温保护：使用蔗糖或甘油等低温保护剂去除样品中的水分，防止冰晶形成。

*冷冻：将样品快速冷冻至液氮温度，以将水分转化为无定形玻璃态。

*修饰：使用焦电子束或等离子体刻蚀器对样品表面进行修饰，以改善电子束穿透性。

自动化切片

近年来，自动化切片系统已成为cryo-EM样品制备中的重要工具。这些系统使用先进的算法和机械臂来控制切片过程，提高效率和精度。自动化切片还可以减少人为错误和样本损失。

影响因素

超薄切片技术的成功取决于以下因素：

*样品质量：固定和低温保护的质量会影响切片时的样品完整性。

*切片刀片的锋利度：锋利的刀片可产生更光滑、更薄的切片。

*切割温度：超薄切片应在液氮温度下进行，以防止样品融化或变形。

*切割速度：优化切割速度可减少切片过程中的应力，从而提高样品的完整性。

总结

低温样品的切片技术在cryo-EM中至关重要，它需要专业知识和仔细优化的步骤。通过使用超薄切片技术、自动化系统和对影响因素的深入理解，可以获得高质量的低温样品切片，从而促进生物大分子的结构解析。第六部分样品载体的选择和优化关键词关键要点样品载体的选择

1.机械稳定性：样品载体应具有足够的机械稳定性，能够在低温条件下承受显微镜的真空和电子束冲击。

2.导电性：载体应具有导电性，以排出样品中的静电，防止图像失真。

3.尺寸和形状：载体应具有适合显微镜焦点的合适尺寸和形状，通常为网格或箔片。

样品载体的优化

1.表面处理：样品载体的表面可通过涂层或等离子体处理进行改造，以增强与样品的亲和力或减少背景噪音。

2.气体透射性：对于需要在特定气体环境中观测的样品，样品载体应具有良好的气体透射性。

3.电化学特性：对于电化学活性的样品，载体应具有合适的电化学特性，以避免样品的破坏或反应。样品载体的选择和优化

在冷冻电子显微镜(cryo-EM)中，样品载体是将样品支撑并维持其冷冻状态的关键元件。样品载体的选择和优化对于获得高质量的cryo-EM图像至关重要。

选择样品载体

样品载体必须满足以下标准：

*导电性：样品载体需要导电，以便从样品中提取多余电子，从而防止荷电积累。

*透电子性：样品载体必须透电子，允许电子束穿透并与样品相互作用。

*物理稳定性：样品载体在液氮温度下必须保持物理稳定，而不会破裂或变形。

*生物相容性：样品载体不能对样品产生不利影响或干扰其结构。

*尺寸合适：样品载体的尺寸必须与显微镜的样品台兼容。

常见的样品载体

常用的cryo-EM样品载体包括：

*铜网格：由薄铜丝制成的网格，具有高导电性、透电子性和物理稳定性。

*金箔：用作支持膜，提供高透电子性，但导电性较差。

*石墨烯：一种单层碳原子，具有优异的导电性和透电子性。

*纳米多孔硅：一种多孔材料，提供大表面积和高透电子性。

优化样品载体

样品载体的优化涉及以下步骤：

*涂层：在样品载体上涂覆一层薄碳，以提高导电性和增强样品附着。

*等离子体清洁：暴露样品载体于低压等离子体，以去除有机污染物并增强表面亲水性。

*厚度优化：选择合适厚度的样品载体，以最大化透电子性和强度。

*形状调整：将样品载体切割成特定形状或尺寸，以适应不同的样品类型和显微镜设置。

样品载体对cryo-EM数据质量的影响

样品载体的质量对cryo-EM数据质量有重大影响，包括：

*对比度：样品载体的厚度和均匀性会影响图像的对比度。

*分辨率：样品载体的结构稳定性和表面平整度会影响图像的分辨率。

*噪声：样品载体的杂质和缺陷会导致图像噪声。

*样品完整性：样品载体与样品的相互作用会影响样品的完整性和构象。

因此，仔细选择和优化样品载体对于获得高质量的cryo-EM数据至关重要，从而促进结构生物学的深入研究。第七部分低温下样品的三维重建低温下样品的三维重建

在冷冻电子显微镜(Cryo-EM)中，低温样品的三维重建是至关重要的步骤，可以生成高分辨率的生物分子结构。此过程涉及将多个二维透射电子显微镜(TEM)图像对齐并合并，以创建样品的详细三维模型。

重建流程

三维重建的流程主要包括以下步骤：

*图像采集：使用Cryo-EM仪器以液氮温度快速冷冻样品，以保持其天然状态。然后使用TEM采集多个二维图像。

*图像对齐：将二维图像对齐，以校正由于样品运动、镜头畸变或图像扭曲而引起的任何错误。此过程通常使用计算机算法，如粒子拾取和自相关技术。

*分类：将对齐的图像分类到不同投影类中。这个过程可以去除不合格的图像并提高重建的质量。

*反投影：将分类后的图像反投影为三维体积。此过程使用一种称为逆投影的技术，将每个图像视为三维对象的投影。

*精修：对三维体积进行精修，以去除噪音、校正错误并增强特征。此步骤通常涉及使用统计模型或机器学习算法。

单颗粒重建

单颗粒重建是Cryo-EM中最常见的三维重建技术。它用于解析单个分子的结构，例如病毒或蛋白复合物。该技术涉及以下步骤：

*分离颗粒：将图像中的单个颗粒分离出来，通常通过粒子拾取算法。

*对齐和平均：将分离的颗粒对齐并平均，以产生颗粒的三维模板。

*反投影：将模板反投影为三维体积，表示颗粒的结构。

体积成像重建

体积成像重建用于解析细胞或组织等较大样品的结构。它涉及以下步骤：

*图像采集：使用Cryo-EM仪器收集样品的倾斜系列图像。

*体积重建：使用计算机算法，如差分层析扫描或同步反投影，将倾斜图像重建为三维体积。

*分割和可视化：对三维体积进行分割，以识别感兴趣的特征和亚细胞结构。

数据处理和分析

低温样品的三维重建涉及大量数据处理和分析。此过程通常使用专门的软件包，如RELION、cryoSPARC和EMAN。这些软件包提供了各种工具，用于图像对齐、分类、反投影和精修。

分辨率评估

重建结构的分辨率是衡量其准确性和清晰度的关键指标。分辨率评估通常通过计算傅里叶壳相关性曲线进行，该曲线比较两个独立重建的半体积的相似性。

应用

低温样品的三维重建广泛应用于生物医学研究，包括：

*解析病毒、蛋白质和细胞器的结构

*研究蛋白质相互作用和复合物组装

*了解病理状态下分子的变化

*药物发现和开发

结论

低温样品的三维重建是Cryo-EM的一项强大技术，可用于生成高分辨率的生物分子结构。该流程涉及图像采集、对齐、分类、反投影和精修。单颗粒重建和体积成像重建是Cryo-EM中常用的两种重建技术，它们具有广泛的生物医学应用。第八部分低温样品制备的质量控制关键词关键要点冷冻水化稳定性的评估

1.评估冷冻水化样品的完整性，确保冷冻过程中没有发生明显的结构破坏或变形。

2.利用高分辨率成像技术，观察蛋白质复合物的细微结构，以检测冷冻诱导的构象变化或解离。

3.使用免疫标记或功能测定，确定冷冻处理后目标蛋白的活性或配体结合能力是否受到影响。

低温条件下的样品厚度

1.确保样品厚度适中，既能产生清晰的图像，又能避免多层重叠或散射干扰。

2.在冷冻前优化样品制备条件，如缓冲液组成、冷冻缓冲剂的浓度和冷冻速率，以获得理想的样品厚度。

3.使用显微镜的倾斜功能或层析成像技术，提高图像的信噪比，减轻样品厚度的影响。

低温诱导的冷冻损伤

1.监测冷冻过程中样品的冰晶形成情况，因为冰晶的生长可能会破坏样品结构。

2.优化冷冻条件，如冷冻缓冲剂的成分和冷冻速率，以最小化冰晶的形成和冷冻损伤。

3.采用先进的冷冻技术，如高压冷冻或冷冻水化，以进一步减轻冷冻损伤。

冷冻样品的存储和运输

1.在极低温下(-140°C或更低)储存冷冻样品，以防止样品降解或晶体生长。

2.使用专门的冷冻运输容器，确保样品在运输过程中保持极低温环境。

3.在运输和储存过程中，监测样品温度，以避免冷冻-解冻循环引起的损坏。

自动化和高通量样品制备

1.采用自动化或半自动化方法，提高样品制备的效率和一致性，减少人为错误。

2.优化高通量样品制备流程，以同时处理多个样品，提高研究吞吐量。

3.利用机器学习和人工智能算法，优化样品制备参数，提高图像质量和数据处理效率。

新兴技术和趋势

1.开发新的冷冻技术，如激光冷冻和电感耦合等离子体冷冻，以提高分辨率和减少冷冻损伤。

2.利用冷冻电子断层扫描术，获取样品的3D结构信息，提供全面的形态学分析。

3.与其他技术相结合，如X射线晶体学和质谱分析，实现冷冻电子显微镜数据的互补和协同分析。低温样品制备的质量控制

低温样品制备是冷冻电子显微镜(cryo-EM)工作流程中至关重要的一步。高质量的样品对于获得高分辨率数据并揭示其结构信息至关重要。为了确保低温样品的质量，需要进行严格的质量控制措施。

视觉检查

视觉检查是评估低温样品质量的第一步。样品应通过电镜网格上的薄冰孔进行观察。理想的样品应具有均匀的冰层，覆盖整个网格孔。冰层应透明无粒，无裂纹或空洞。

粒度分析

粒度分析用于表征样品的粒径分布。这可以通过图像处理软件或手动测量颗粒的直径来完成。单分散样品，其中大多数颗粒具有相似的尺寸，对于高分辨率成像更为理想。

浓度测量

样品的浓度应测量以确保获得足够的数据。浓度可以通过光学显微镜或使用Bradford蛋白测定法进行定量。理想的浓度将因显微镜类型和使用的放大倍率而异。

冰厚测量

冰层厚度对于cryo-EM非常重要，因为它会影响图像对比度和分辨率。冰层厚度可以通过测量单个冰孔的深度来估算，也可以通过tomography测量。理想的冰层厚度约为100-200纳米。

样品稳定性

样品的稳定性是质量控制的另一个重要方面。样品应能承受cryo-EM条件，例如低温和电子束照射。样品