基因工程的基本操作程序（第1课时）高二下学期生物人教版选择性必修3

基因工程的基本操作程序年级：高二学科：生物学（人教版）背景：1992年，我国北方棉铃虫连年大暴发，减产造成严重经济损失，棉农“谈虫色变”。原本种植期喷洒两三次的农药，由于一遍遍打农药产生了抗药性，接连喷洒多次也不见效果，因施药过量土壤受到极大污染，稻田无法正常耕种。1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉，2015年我国100抗虫棉新品种多个40减少农药容量万吨450增收节支社会效益亿元你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？目的基因的筛选与获取培育培育转基因抗虫棉主要步骤基因表达载体的构建目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的筛选与获取培育培育转基因抗虫棉主要步骤什么是目的基因？筛选与获取目的基因方法有哪些？一、目的基因的筛选与获取用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因1.目的基因主要是指编码蛋白质的基因抗逆性基因生产药物基因毒物降解基因工业用酶基因①定义非编码区非编码区编码区启动子终止子RNA聚合酶的结合位点，转录起始的信号编码蛋白质的合成终止RNA的合成②

基因的结构原核生物的基因结构非编码区非编码区编码区启动子终止子外显子内含子真核生物的基因结构②

基因的结构非编码区非编码区编码区转录剪接外显子内含子前体mRNA成熟mRNA真核生物的基因结构②

基因的结构2.筛选合适的目的基因在浩瀚的“基因海洋”中找到所需要的目的基因往往不容易，从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。①明确目的基因已知结构和功能清晰的基因目的基因当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只在某些昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。Bt基因Bt抗虫蛋白编码

苏云金杆菌含有测序技术测定核酸和蛋白质序列序列数据库(如GenBank)以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库序列对比工具(如BLAST)把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能Q：明确了目的基因后，该怎么获得它呢？②筛选目的基因的技术手段2.筛选合适的目的基因我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的过程中，科学家人工合成了目的基因。DNA合成仪①人工合成法在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成。3.

获取目的基因的方法根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。原理②PCR扩增（聚合酶链式反应）常用方法PCR仪3.

获取目的基因的方法(1)原理：半保留复制(2)条件：⑥缓冲液②DNA模板⑤2种引物③4种脱氧核苷酸④耐高温的DNA聚合酶①高温(替代解旋酶)②PCR扩增（聚合酶链式反应）2种引物短单链核酸(DNA或RNA)

本质：作用：使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸

引物连接模板链的3’端

游离的脱氧核苷酸连接在引物的3’端

注意：1种引物会导致引物与引物之间结合形成双链，不能与模板链结合。-3′5′-3′--5′子链延伸-5′3′-5′--3′子链延伸PCR的过程4种脱氧核苷酸引物耐高温的DNA聚合酶DNA模板第①步：变性当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链。第②步：复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。PCR的过程第③步：延伸当温度上升到72℃时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。3′5′5′3′PCR的过程3′5′3′5′5′3′5′3′5′3′第1轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。PCR的过程3′5′3′5′5′3′5′3′5′3′第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。PCR的过程模板DNA目的基因3′5′5′3′引物1引物2原料Taq聚合酶507295℃PCR三轮扩增过程目的基因3′5′5′3′507295℃第一轮：高温变性PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第一轮：高温变性PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第一轮：高温变性PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第一轮：低温复性PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第一轮：中温延伸PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第二轮：高温变性PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第二轮：高温变性PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第二轮：低温复性PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第二轮：中温延伸PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第三轮：高温变性PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第三轮：高温变性PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第三轮：低温复性PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第三轮：中温延伸PCR三轮扩增过程3′5′5′3′507295℃第三轮：中温延伸PCR三轮扩增过程PCR小结①过程变性目的基因DNA受热变性后解为单链复性2种引物与单链相应互补序列结合延伸以DNA单链为模板，在耐高温的DNA聚合酶作用下延伸。即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端1个模板DNA分子经过n轮PCR，以指数形式扩增，可以扩增出约2n个DNA片段。②结果：(超过90℃)(50℃左右)(72℃左右)③PCR技术获取目的基因时至少要经过3次循环才能从DNA分子中分离出目的基因④经过n轮复制，需要引物

个只有两条母链上没有引物2n+1-2⑤常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化边解旋边复制DNA在高温下变性解旋全部解旋后在复制场所主要在细胞核内细胞外（主要在PCR扩增仪内）酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度，需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板②

原料：均为四种脱氧核苷酸③

酶：均需DNA聚合酶④

引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端合成子链将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。4.通过构建基因文库获取目的基因

基因组文库部分基因文库基因文库①基因组文库基因文库就像一座图书馆，每一个基因就是一本书。如果一座“图书馆”中包含了一种生物所有的基因，那么，我们就可以说这个基因文库很大，就像国家图书馆，这种基因文库叫做基因组文库。一种生物的一部分基因叫做部分基因文库国家图书馆（基因组文库）部分基因文库一种生物的全部基因叫做基因组文库。4.通过构建基因文库获取目的基因

一种生物的一部分基因叫做部分基因文库国家图书馆（基因组文库）部分基因文库一种生物的全部基因叫做基因组文库。有一些基因文库比较小，就像某个市或某个单位的图书馆，只包含一种生物的一部分基因，这种基因文