生物化学：第六章 核酸

第六章

核

酸二十世纪是二十一世纪是物理学生命科学的世纪的世纪生命是生命=核酸+蛋白质二十一世纪是核酸、蛋白质的世纪？第一节核酸概论

一、核酸的发现和研究简史二、核酸的种类和分布（一）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA)原核：裸露的DNA分子集中于核区真核：细胞核DNA：存在细胞核中，与组蛋白、非组蛋白形成染色体细胞器DNA：存在线粒体和叶绿体中，双链环形，一般裸露（二）核糖核酸（ribonucleicacid,RNA)1、转移RNA（transferRNA,tRNA):

保守性最强2、核糖体RNA（ribosomalRNA,rRNA)3、信使RNA（mesengerRNA,mRNA)4、特殊功能的RNASmallnuclearRNA,snRNASmallnucleoarRNA,snoRNASmallcytoplasmicRNA,scRNAAntisenseRNARibozymeRNaseP三、核酸的功能（一）DNA是主要的遗传物质1944，O.Avery

肺炎双球菌转化实验1952，A.DHershey和M.Chase噬菌体感染实验（二）RNA功能的多样性1、参与蛋白质的合成2、RNA的转录后加工与修饰3、参与基因表达的调控4、生物催化作用第二节核酸的结构核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)

磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)

戊糖(pentose)碱基(base)一、核酸的化学组成王镜岩P479表13-1两类核酸的基本化学组成RNA：D-核糖，A、G、C、U碱基，磷酸DNA：D-2-脱氧核糖，A、G、C、T碱基，磷酸

（一）.碱基王镜岩P479或p158图5－1结构式1.嘧啶碱：尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧2.

嘌呤碱：腺嘌呤鸟嘌呤

嘌呤衍生物：

3.核酸中的修饰碱基：100余种，一般是五种主要碱基的衍生物，多数是甲基化的产物；tRNA的修饰碱基种类较多，并且修饰碱基含量不一，有的可达10％或更多。王镜岩P479表13-2核酸中的稀有碱基（二）、

核苷与脱氧核苷1、基本核苷P160图5－2结构式腺嘌呤核苷胞嘧啶脱氧核苷★嘧啶碱：C1—N1，嘌呤碱：C1—N9。★核酸中的核苷与脱氧核苷均为β-型★碱基平面与核糖平面互相垂直2、核酸中的稀有核苷★稀有碱基★稀有糖苷键：假尿嘧啶核苷（ψ）P159★甲基化核糖（三）、

核苷酸核苷中戊糖C2

、C3、C5羟基被磷酸酯化王镜岩P481结构式：5’-AMP3’-dCMP1、

构成DNA、RNA的核苷酸

P160表5-3DNA：由四种脱氧核苷酸组成，dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA：由四种核苷酸组成，AMP、

GMP、CMP、UMP2、

细胞内的游离核苷酸及其衍生物①核苷5’-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。②环核苷酸3’,5’-cAMP，3’,5’-cGMP信号分子，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物ppGpppppGppppApp④核苷酸衍生物HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。二、

DNA的结构一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二级结构：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。（一）、

DNA的一级结构蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸王镜岩P482图13-1磷酸二酯酶对核酸的水解作用1.DNA的一级结构是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3’、5’-磷酸二酯键连接起来的线形或环形多聚体。王镜岩P483图13-2DNA中多核苷酸的一个片段及缩写符号

写法：5’→3’：5’-pApCpTpG-3’，或5’…ACTG…3’2.

DNA一级结构的不均一性（1）重复序列★正向重复(repeat)★反向重复（回文序列）(invertedrepeat,palindromesequence)较长的回文结构，可形成茎环结构(发夹结构)或十字形结构较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。转录的终止作用与回文结构有关。★镜象重复（mirrorrepeat)某些情况下可以三股螺旋DNA（1）高度重复序列：真核生物DNA分子中，重复几百万次，一般小于10个碱基对的短顺序。（highrepetivesequence,sateliteDNA，SSR)2-10bp/copy105-106copies/genome多为串联重复排列（tandemrepeats)分布于着丝点、端粒区、结构基因两侧（2）中度重复序列（middlerepetitivesequence)：真核生物DNA分子中至少重复1000次的顺序。0.1-1Kb/copy，10-104copies/genome。多为间隔重复，如rRNA,tRNA,基因及某些蛋白质基因（如组蛋白，肌蛋白，角蛋白等）（3）低拷贝重复：真核生物DNA分子中重复几次的碱基顺序。基因家族（4）单拷贝序列（singlecopysequence)：真核生物DNA分子中不重复的碱基顺序。如珠蛋白，卵清蛋白，丝心蛋白基因等。而原核生物DNA分子中一般没有重复顺序。（2）富含AT的序列很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT碱基对。特别是在复制起点和转录启动的Pribnow区，富含AT对。（二）、

DNA的二级结构1953年，Watson和Crick根据Chargaff规律和DNANa盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。★DNA组成的

Chargaff规律1950年a.所有生物的DNA中，A=T，G=C且A+G=C+T，A+C=G+T。王镜岩P485表13-5。b.DNA的碱基组成具有种的特异性。c.DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。d.年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。★DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析。Franklin1、

Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA)王镜岩P486图13-5★两条反平行的多脱氧核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’★磷酸与脱氧核糖彼此通过3‘、5‘-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。★磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。★碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行★两条脱氧核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起。A与T形成两个氢健，G与C形成三个氢健。★螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持★每圈螺旋含10对脱氧核苷酸，碱基对堆积距离0.34nm，螺距为3.4nm,每对脱氧核苷酸旋转36度，双螺旋平均直径2nm，★大沟：宽1.2nm，深0.85nm，小沟：宽0.6nm，深0.75nm★两条反平行的多脱氧核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’★磷酸与脱氧核糖彼此通过3‘、5‘-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。★磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。★碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行★两条脱氧核苷酸链之间依靠碱基间的氢健结合在一起。★螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持★每圈螺旋10个脱氧核苷酸对即碱基对，相邻碱基对的碱基堆积距离0.34nm，螺距为3.4nm,每对脱氧核苷酸旋转36度，双螺旋平均直径2nm，★大沟：宽1.2nm，深0.85nm，★小沟：宽0.6nm，深0.75nm2、稳定双螺旋结构的因素①碱基堆积力形成疏水环境（主要因素）。②碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。③离子健:磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。3、

DNA二级结构的多型性王镜岩P489表13-6A-、B-、Z-DNA的比较相对湿度92%：B—DNA相对湿度75%：A—DNA。

（1）

B—DNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA右手双螺旋每圈螺旋10.4个碱基对螺距：3.32nm（2）

A-DNA右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。（3）Z-DNA左手螺旋，外形细长。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。（4）

三股螺旋DNAK.

Hoogsteen1963通常是一条同型寡脱氧核苷酸与寡嘧啶脱氧核苷酸-寡脱氧嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合：oligo(Py):oligo(Pu)—oligo(Py/Pu)★第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤T=A:T,C≡G：C+T=A:AC≡G：G王镜岩P489图13-10三股螺旋DNA中的Hoogsteen-bonding★第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按Hoogsteen配对★当DNA的一段寡嘧啶（寡嘌呤）构成镜像重复时可以形成三股螺旋（铰链DNA，hingedDNA,H-DNA)P490

图13-11H-DNA的结构★DNA三股螺旋结构常出现在DNA复制、转录、重组的起始位点或调节位点，如启动子区。第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。(三）、

DNA的三级结构DNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象★超螺旋是DNA三级结构的主要形式。1、

环状DNA的三种典型构象王镜岩P491图13-12（1）、

松弛环形DNA线形DNA直接环化（2）、

解链环形DNA线形DNA拧松后再环化（3）、

正超螺旋与负超螺旋DNAMOV:PBC\A0267501\supercoilingofDNA2、三种环形DNA的拓扑学特性①连环数（linkingnumber,L）DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数②扭转数（twistingnumber,T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示③超螺旋数（缠绕数,writhingnumber,W）：连环数（L）缠绕数（T）扭曲数W松驰环25250解链环23230超螺旋2325-2L=T+W④比连环差（specificlinkingdifference,λ）表示DNA的超螺旋程度(Superhelixdensity)λ=（L—L0）/L0=每一圈初级螺旋（10bp，360°）出现超螺旋数L0是指松驰环形DNA的L值一般天然DNA分子中σ=-0.05－5%负向超螺旋SV405226bpT=522W=-26(L=496)σ=-0.05负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起（L），很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等3、

拓扑异构酶改变DNA拓扑异构体的L值。①拓扑异构酶酶I（解旋酶）能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每次催化使L值增加1。②拓扑异构酶酶II（促旋酶）能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2。4、染色体的结构（1）、整个病毒可以看成游离的染色体组成：核酸、蛋白、脂类、糖类基因组：单链或双链的DNA（或RNA），多数环状形状：丝状、多面体状、王镜岩P493图13-13一些噬菌体的结构（2）、细菌染色体的结构——

（拟核，nucleoid)细菌基因组多数为双链环状DNA，与碱性蛋白、RNA结合，形成带有无数突环的刷状染色体王镜岩P494图13-15细菌的拟核结构（3）、真核生物染色体的结构染色质、染色体常染色质、异染色质永久性异染色质、功能性异染色质核小体（nucleosome):146bp,组蛋白：H2A、H2B、H3、H4各两分子，连接核小体的DNA片段结合一分子H1。王镜岩P495图13-17真核生物染色体DNA的组装层次MOV：MCB4.0\threedimensionalpackingofnuclearchromosomes三、

RNA的结构（一）、

RNA的一级结构P483四种核苷酸AMP、GMP、CMP、UMP通过3’、5’磷酸二酯键形成的线形多聚体。

王镜岩P484图13-3RNA分子中的一段结构①

组成RNA的戊糖是核糖②

RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有碱基。③

天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。（二）、

tRNA的结构★70-90b，分子量在25kd左右，沉降系数4S左右★有较多稀有碱基★3’末端为…CCA-OH，接受氨基酸★5’末端大多为pG…或pC…★二级结构是三叶草形★倒L形的三级结构

王镜岩P496三叶草形的二级结构氨基酸臂：3’末端为…CCA-OH，接受氨基酸二氢尿嘧啶环即D环反密码环：含反密码子额外环TC环（假尿嘧啶环）P190图5－34倒L形的三级结构（氢健）★tRNA的功能：●转运氨基酸●识别密码子●参与翻译起始●参与DNA的反转录●参与基因表达调控（三）、

mRNA的结构原核：多顺反子（polycistronicmRNA),以操纵子为转录单位，产生多顺反子即一条mRNA链上有多个编码区，都无修饰碱基。真核：单顺反子，断裂基因（splitedgene)，以操纵子为转录单位，产生单顺反子即一条mRNA链上有一个编码区，有极少修饰碱基。为断裂基因（splitedgene)，内含内含子（基因中不编码的居间序列）。1、

真核mRNA的结构王镜岩P484图13-4真核mRNA的结构★

5’-帽子：m7G5’-ppp5’-Nm（

Nm）p-O型：m7G5’-ppp5’-Np-I：m7G5’-ppp5’-Nmp-Np-II:m7G5’-ppp5’-Nmp-Nmp-Np-甲基鸟苷5’，5’-三磷酸●由甲基化酶催化●可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。●可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。★

3’-端有一段约30-300核苷酸的polyA尾。

●转录后由poly(A)聚合酶催化加尾●PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。●polyA与mRNA半寿期有关，PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。2、

原核mRNA的结构（多顺反子）★由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5’帽子和3’polyA尾。★SD序列：5’端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10个核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。★SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补。3.mRNA的功能：以mRNA的为模板指导蛋白质合成。（四）、

rRNA的结构细菌：16SrRNA

、5SrRNA、23SrRNA组成30S转录单位真核：18SrRNA、5.8SrRNA，28SrRNA组成45S的转录单位，5SrRNA单独转录。小亚基大亚基转录单位原核1652330真核185（单独转录）285.85+45大肠杆菌5SrRNA结构P498图13-2016S、5SrRNA的结构★rRNA的功能：●组成核糖体●催化肽键形成的转移酶活性存在于23SrRNA上●参与tRNA与mRNA的结合第三节

核酸的物理化学性质一、核酸的水解（一）酸水解★对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸二酯键嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键★脱嘌呤：

pH1.6，37℃，对水透析

pH2.8，100℃，1h★脱嘧啶：

98-100%甲酸，175℃，2h

三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或80min（RNA）★利用酸水解可以研究核酸的碱基组成（二）、

碱水解★RNA的磷酸酯键对碱敏感室温，0.3~1mol/LKOH，24h，先形成2’-和3’-的环磷酸酯，可将RNA完全水解，得到2’-或3’-核苷酸的混合物。★DNA抗碱水解★生理意义：DNA更稳定，可用于DNA和RNA的分离。（三）、

酶水解★非特异的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸★特异的磷酸二酯酶：核酸酶1、核酸酶的分类★底物专一性：核糖核酸酶RNase

脱氧核糖核酸酶DNase★作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶(endonuclease)单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶★磷酸二酯键的断裂方式：5’-（寡）核苷酸3’-（寡）核苷酸2、RNAase★RNaseH作用于DNA-RNA中的RNA链，内切酶。★牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease),RNaseI最适pH：7.0-8.2产物：以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶★RNaseT1耐热、耐酸产物：以3’-鸟苷酸结尾的寡核苷酸或3’-鸟苷酸，专一性更高，也是内切酶。★RNaseT2产物：以3’-腺苷酸结尾的寡核苷酸，内切酶。3、DNase★核酸酶S1作用于单链DNA部分，为内切酶。★牛胰脱氧核糖核酸酶，DNaseI切断双链或单链DNA产物：以5’-磷酸为末端的寡核苷酸★DNA限制性内切酶：主要是降解外源DNA。目前已找到的已有数千种，主要用于基因工程的工具酶，在基因工程中广为应用的也有几百种。4、N-糖苷酶：具有碱基特异性或非特异性，水解糖苷健。二、

核酸的酸碱性质磷酸和碱基均能发生两性解离。DNA等电点4—4.5RNA等电点2—2.51、碱基的解离王镜岩P504由于嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮以及各种取代基具有结合和释放质子的能力，所以这些物质既有碱性解离又有酸性解离的性质，但主要是碱基中的氮的解离。2、核苷的解离王镜岩P5051)核糖的存在降低了碱基的解离常数，即增强了碱基酸性解离。2）核糖也可以解离，但解离常数通常在12以上，一般不去考虑它。3、核苷酸的解离王镜岩P506表14-1某些碱基、核苷、核苷酸的解离常数1）增加了磷酸基的两个羟基解离。在多聚核苷酸中磷酸二酯健只有一个解离，并代负电荷。2）腺苷酸，鸟苷酸，胞苷酸可以形成兼性离子，

pI=1\2(pk1’+pk2’)。尿苷酸的碱基碱性极弱，故不能形成兼性离子。4、核酸的滴定曲线P507

图14-1核苷酸的滴定曲线P507图14-2小牛胸腺DNA的滴定曲线DNA的酸碱滴定曲线对了解DNA的酸碱变性很有帮助。三、

核酸的紫外吸收碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，λmax=260nm1、

鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。2、

含量计算：以DNA或RNA标准品作标准曲线，可测定样品中DNA或RNA的含量。1个光吸收值值相当于：50ug/mL双螺旋DNA

或：40ug/mL单链DNA（或RNA）

或：20ug/mL寡核苷酸3、判断DNA是否变性或降解在DNA的变性过程中或降解时，其紫外吸收值增大叫增色效应。在DNA的复性过程中，其紫外吸收值减小叫减色效应。四.核酸的溶解性质1.DNA和RNA都能溶解在水溶液中，而不溶于乙醇和氯仿等有机溶剂中。可以利用乙醇把核酸从水溶液中沉淀下来。2.DNP和RNP复合体:DNP不溶于低浓度的盐浓度中，如0.14M的氯化钠，但RNP能溶解。但在1M的氯化钠溶液中，DNP可以完全溶解。利用这一性质可以将它们从生物材料中分别提取出来，除去蛋白质，即可以得到DNA和RNA。五、

核酸的变性、复性及杂交(一)、

变性王镜岩P508图14-4DNA变性过程；p195图5－39★核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。

★变性因素：热变性酸碱变性（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）

★变性后的理化性质：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。

★

增色效应与减色效应增色效应：在DNA的变性过程中，光吸收值增大减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。1、

熔解温度（Tm）：★DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。浓度50ug/mL时，双链DNAA260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37；当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在82—95℃之间2、

影响DNA的Tm值的因素①DNA均一性。均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性。②G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44王镜岩P509图5-19图14-5Tm值与GC含量的关系③介质中离子强度离子强度高，Tm高，而且熔解过程发生在一个较小的温度范围之内。P509图14-6RNA的变性RNA也有螺旋到线团的转变即变性。但是由于RNA只有局部的双螺旋区，所以这种转变不如DNA那样明显。变性曲线不那么陡，Tm值较低。tRNA具有较多的双螺旋区，所有具有较高的Tm值，变性曲线也较陡。双链RNA的变性几乎与DNA的相同。(二)、

复性变性DNA在适当（一般低于Tm20—25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。★热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，叫退火。快速冷却不能复性。★DNA片段越大，复性越慢；★DNA浓度越大，复性越快。★复性速度可用Cot1/2。表示复性一半时的Cot。Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。王镜岩P352图5-22，不同DNA的复性动力学曲线。●1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0mmol/L，则50%复性时，Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒全部复性，Cot=10-4，t=0.1秒●E.coli4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0umol/L，则复性50%，Cot1/2=10mol.s/L，t=107秒，约115天。复性100%，Cot=500mol.s/L，t=5×108秒，5758天。●根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数(三)分子杂交1、

SouthernBlottingDNA样品→酶切→电泳→碱变性→转膜→固定→杂交→洗涤→放射自显影变性（NaOH0.5mol/L）转膜（NC膜，尼龙膜）固定（80℃，4-6h）杂交（加变性探针DNA杂交，高盐浓度，68℃，几小时，即复性）SouthernBlotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。2、

NorthernBlotting研究对象是mRNA，探针一般是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）3、

WesternBlotting抗原与抗体的杂交研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。第四节

核酸研究技术一、

核酸的分离纯化和定量尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。（一）、

DNA分离纯化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质，从而得到DNA粗制品。水相中的DNA可被0.3MNaAC-70%乙醇沉淀得到DNA粗制品。（二）、RNA的制备不同的RNA存在细胞的不同部位，先采用差速离心法分离不同的RNA。★RNase

的灭活：玻璃器皿：140-200℃，8h塑料器皿：0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯），37℃，过夜；或高压灭菌。提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍。反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂。★用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清液中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白质，得RNA粗制品。★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法，用他们抽提除净蛋白质。用于小量制备RNA.★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法，可以制备较大量高纯度的天然RNA。蛋白质：＜1.33g/mlDNA：1.71g/ml左右RNA：＞1.89g/ml★mRNA的制备：oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法，mRNA被吸附在凝胶柱上，洗涤后用低离子强度缓冲液回收mRNA，得到较高质量的制品。（三）、核酸的定量王镜岩P5141.核酸的定量测定方法紫外分光光度法定磷法定糖法2.细胞或生物组织的核酸含量测定应进行预处理热酸法：RNA+DNA冷酸法:RNA和DNA分开碱法:RNA+DNA分开二、核酸的沉降特性与超速离心不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒DNA的纯化。（一）密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度：8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：浮力密度Ρ0：标准DNA的密度ω：角速度（弧度/秒）r：样品到转轴的距离（二）密度梯度超速离心测定DNA的G-C含量G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值。（三）密度梯度超速离心研究核酸的构象RNA＞DNA变性DNA＞双链DNA＞蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大。核酸的不同构象具有不同的浮力密度，可以利用此技术研究核酸的构象变化及其动力学过程。（四）密度梯度超速离心纯化RNA或不同构象的DNA即用于核酸的制备超螺旋DNA或三、

核酸的凝胶电泳（一）、

琼脂糖凝胶电泳用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广★影响迁移率的因素：①

核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比②

凝胶浓度：与胶浓度成反比，常用1％胶分离DNA。③

DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。④

电压，不大于5V/cm,在适当的电压差范围内，与电压成正比。★染色：0.5ug/mlEB（溴化乙锭），与DNA结合后可发射红－橙色可见荧光。★RNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛使核糖核酸酶被去掉。★琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定。凝胶上的样品可以回收，以供进一步研究用。★琼脂糖电泳可以用于DNA的制备与纯化。（二）、

PAGE电泳1.孔径比琼脂糖要小，用于小片段DNA（小于1000bp)和RNA的分析，精度非常高。2.尽管PAGE中不含RNase,但还是要留心缓冲液及其他器皿中所带带Rnase。3.浓度低的RNA要用亚甲蓝或银染来显示，因为其双螺旋区少。四、限制性核酸内切酶与DNA物理图谱构建（1979年发现）(一)、

细菌的限制性核酸内切酶－修饰甲基化酶系统限制性核酸内切酶：在细菌体内发现的一类能识别DNA特定核苷酸顺序的核酸内切酶叫限制性核酸内切酶限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时在细菌体内成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志（即在限制性核酸内切酶的识别顺序处被甲基化），限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA，而自身DNA不被降解。(二)、

II型限制性核酸内切酶限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。★II型酶的切割频率识别位点444=256646=4096848=65536

★限制酶的命名：E.coRI第一位：属名E（大写）第二、三位：种名的头两个字母小写co第四位：菌株R第五位：从该细菌中分离出来的这一类酶的编号★同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端（有些限制性核酸内切酶的切口是交错的，产生能互相发生配对的末端）。平头末端：有些限制性核酸内切酶产生的末端为平头的。如HindⅡ,HindⅢ。

BamHI：GG↓ATCC

BstIGG↓ATCCMboIGAT↓CSau3AGAT↓C★同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。BclITG↓ATCA

BglIIAG↓ATCA

★星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。

例如HindIIIAAG↓CTT(三)、

DNA物理图谱及构建（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）一个DNA分子用限制性内切酶或DNA酶降解后得到许多大小不同的片断，确定这些片断在DNA大分子中原来占据的位置，即可得到一种图谱。这样的图谱就叫物理图谱或酶切图谱。在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础。★末端标记法构建DNA物理图谱：（1）单酶完全降解和部分降解（DNA酶