微生物的生长及其控制

微生物的生长及其控制一、微生物的生长个体生长：同化作用速度超过异化作用，原生质总量（重量、体积、大小）不断增加，出现个体生长。个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖微生物学中的“生长”均指群体生长。1、测定生长量的方法直接法间接法直接法测体积：适用于菌量大的样品，初步比较用。待测培养液置于刻度离心管中→沉降或离心→计算菌体体积（包括细胞体积和细胞之间的空隙体积）称干重：适用于菌量大的样品。离心法：离心→干燥[100~105℃或红外线烘干或真空干燥（40℃或80℃）]→称干重过滤法：过滤（滤纸或醋酸纤维膜过滤）→洗涤→真空干燥（40℃）→称干重间接法比浊法原生质含量↑→培养液浊度↑用分光光度计测出待测培养液的浊度，对照标准曲线，求出菌体浓度，结果为相对值。不适用于含非细胞固形物多的样品和丝状微生物。生理指标法：测含氮量，含碳量，P、DNA、RNA、ATP、DAP、N-乙酰胞壁酸的含量。LimitationsofturbiditycountIndirectcountingDeadcellsandlivingcellsarenotdistinguishedParticlesinculturedisturbmeasurementNotgoodathighconcentrations2、Totalcounts（全菌计数法）血球计数板法（countingchamber）：常规方法用血球计数板在显微镜下直接计数。LimitationsofmicroscopiccountDeadcellsandlivingcellsareallcountedSmallcellsaredifficulttocountNeedhighcellconcentration,106cells/ml血球计数板1个大方格分为25个中方格，每个中方格分为16个小方格1个大方格分为16个中方格，每个中方格分为25个小方格计数室容积=1×1×0.1mm31ml菌液中的总菌数=×25×104×稀释倍数

1ml菌液中的总菌数=×16×104×稀释倍数计菌器3、Viablecounts（活菌计数法）Platecounting（平板菌落计数法）：不适用于严格厌氧菌Spread-platemethod（平板表面涂布法）Pourplatemethod（琼脂培养基浇注法）LimitationsofplatecountingToomanyvariablesInoculumsizeSuitabilityofmediumIncubationconditionsLengthofincubationSizeofcoloniesSinglecolonymayarisefrommorethanonecell-cellclumpcfu/ml：colony-formingunit/ml4、酵母活细胞计数美蓝染色法活细胞无色，死细胞为兰色。原理：美蓝是一种弱氧化剂，氧化态呈兰色，还原态呈无色。活的酵母细胞因新陈代谢的不断进行，具有一定的还原能力，能将进入细胞的美蓝还原，而细胞不被染色。二、同步生长1、获得同步生长的方法同步生长：细胞群体处于分裂步调一致的状态。获得同步生长的方法：诱导法：改变环境条件，用控制温度、光线、培养基成分、或者用能够影响细胞周期中主要功能的代谢抑制剂等条件，诱导同步生长。机械筛选法：选择性过滤法、密度梯度离心法或膜洗脱法等。原理：在非同步生长的微生物中，微生物处于不同的生长阶段，体积、大小和重量不一，可用不同孔径的滤膜过滤或密度梯度离心，选出同一生长阶段的微生物。2、同步生长曲线—阶跃性曲线Bycarefulselectionofcellsthathave

justdivided,abacterialpopulationcanbe

synchronizedinthebacterialcelldivisioncycle.

Synchronycanbemaintainedforonlyafewgenerations.

Thesynchronousgrowthofabacterial

population.

三、微生物的生长曲线单细胞微生物的典型生长曲线把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的条件下，它们的群体就会有规律的生长起来。以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就得到微生物的典型生长曲线。根据微生物的生长速率常数R不同，可分为：Lagphase（延滞期、调整期、适应期）Exponentialphase（指数期、对数期）Stationaryphase（稳定期、平衡期）Deathphase（衰亡期）1、Growthcurve-lagphase特点生长速率常数R=0细胞形态变大或增长细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈碱性。合成代谢活跃，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。影响因素菌种特性接种龄接种量培养基成分2、Growthcurve-exponentialphase特点：R最大，增代时间（代时G）或倍增时间最短。细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀。酶系活跃，代谢旺盛。特征参数繁殖代数n：n=3.322(lgx2–lgx1)生长速率常数R：R=n/(t2–t1)=3.322(lgx2–lgx1)/(t2–t1)代时G：G=1/R=(t2–t1)/3.322(lgx2–lgx1)

影响因素菌种特性营养成分营养物浓度培养温度培养温度的影响E.coli在不同温度下的代时温度℃代时温度℃代时108603522151204017.520904520254047.57730293、Growthcurve-stationaryphase特点：R=0，菌体产量达到最高点。细胞开始储存糖原、异染颗粒和脂肪等储藏物。以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期。稳定期到来的原因营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调；有害代谢产物累积；pH、氧化还原电势等物化条件不适宜。4、Growthcurve-deathphase特点：个体死亡速度>新生速度，群体呈现负生长；细胞形态多样；细胞产生自溶；产生或释放抗生素；芽孢杆菌中芽孢的释放。衰亡期到来原因：环境条件越来越不利，从而引起细胞内分解代谢大大超过合成代谢，导致菌体死亡。5、Theapplicationofgrowthcurve缩短lagphase，以缩短发酵周期；取exponentialphase的种子接种延长exponentialphase，有利于形成大量的微生物细胞；采用连续培养延长stationaryphase，有利于代谢产物积累；根据细胞内含物判断菌龄；根据生长期控制培养条件。四、连续培养连续培养：当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流进新鲜培养基，并立即搅拌均匀；另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。这样，培养物就达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上。连续培养器的类型

内控制（控制菌体浓度）：恒浊器

外控制（控制培养液流速，以控制生长速率）：恒化器

单级连续培养器

多级连续培养器

一般连续培养器

固定化细胞连续培养器

实验室科研用：连续培养器

发酵生产用：连续发酵罐按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分按用途分恒浊器恒浊器（turbidostat）：根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。恒化器恒化器（chemostat）：一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。恒浊器与恒化器的比较装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度无限制不恒定最高速率大量菌体生产为主（内控制）生长因子或与菌体相平行的代谢产物恒化器培养基有限制恒定低于不同生长实验室流速生长因子最高速率速率菌体为主（外控制）连续培养的优点优点高效节约了大量动力、人力、水和蒸汽自控产品质量较稳定连续培养的缺点缺点菌种易于退化易遭杂菌污染营养物的利用率低五、影响微生物生长的主要因素温度氧气pH渗透压和水活度1、Temperature

最低生长温度：一般为-5~-10℃，极端为-30℃嗜冷菌：＜20℃生长温度最适生长温度中温菌：20~45℃嗜热菌：＞45℃最高生长温度：一般为80~95℃最适生长温度：分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。最适生长温度≠发酵速度最高时的培养温度≠代谢产物量最高时的温度≠生长量最高时温度微生物各生理过程的不同最适温度菌名生长温度℃发酵温度℃累积产物温度℃嗜热链球菌374737乳酸链球菌3440产细胞：25~30产乳酸：30灰色链霉菌3728—北京棒杆菌3233~35—丙酮丁醇梭菌3733—产黄青霉3025202、O2根据微生物与氧的关系，可分为：

专性好氧菌：在正常大气压（0.2巴）下好氧呼吸产能以呼吸为主，兼营发酵产能好氧菌兼性厌氧菌以呼吸为主，兼营厌氧呼吸产能微好氧菌：只能在0.01~0.03巴的大气压下生活耐氧菌：不需氧，只能以发酵产能，但氧无毒害厌氧菌（专性）厌氧菌：氧有害或致死，以发酵或无氧呼吸产能O2+eO2

.2O2

.+2H+H2O2+O2

NADH2NAD

SOD好氧生物及耐氧菌过氧化氢酶好氧生物过氧化物酶耐氧菌H2O+½O2

2H2O厌氧菌的氧毒害机制3、pHpH：-lg[H+]，指外界环境的pH值嗜碱微生物最适生长pH值偏于碱性（如多数放线菌）耐碱微生物微生物（如链霉菌）嗜酸微生物最适生长pH值偏于酸性（多数真菌）耐酸微生物（乳酸杆菌）不同微生物的生长pH范围微生物pH值最低最适最高氧化硫硫杆菌0.52.0~3.56.0嗜酸乳杆菌4.0~4.65.8~6.66.8大豆根瘤菌4.26.8~7.011.0褐球固氮菌4.57.4~7.69.0一种亚硝化单胞菌7.07.8~8.69.4醋化醋杆菌4.0~4.55.4~6.37.0~8.0金黄色葡萄球菌4.27.0~7.59.3泥生绿菌6.06.87.0水生栖热菌6.07.5~7.89.5黑曲霉1.55.0~6.09.0一般放线菌5.07.0~8.010.0一般酵母菌3.05.0~6.08.0

几种抗生素产生菌的生长与发酵的最适pH

抗生素产生菌生长最适pH合成抗生素最适pH灰色链霉菌6.3~6.96.7~7.3红霉素链霉菌6.6~7.06.8~7.3产黄青霉6.5~7.26.2~6.8金霉素链霉菌6.1~6.65.9~6.3龟裂链霉菌6.0~6.6 5.8~6.1灰黄青霉6.4~7.06.2~6.5pH微生物在生命活动过程中，会改变外界环境中的pH值。糖类发酵、氧化有机酸有机物脂肪水解有机酸培养基内蛋白质脱羧胺类中性成分(NH4)2SO4NH4+选择吸收H2SO4无机盐

NaNO3NO3-选择吸收NaOHpH调节方法

过酸时：加NaOH、Na2CO3等碱中和过碱时：加H2SO4、HCl等酸中和加适当氮源：如尿素、NaNO3、过酸时NH4OH或蛋白质等“治本”提高通气量过碱时加适当碳源：糖、乳酸、甘油等降低通气量加磷酸缓冲液（K2HPO4—KH2PO4）

加CaCO3或NaHCO3“治标”外源调节内源调节六、有害微生物的控制几个基本概念灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物（包括病原微生物和非病原微生物）永远丧失其生长繁殖能力的措施。消毒：采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。如：巴氏消毒法。防腐：利用某种理化因素（低温、缺氧、干燥、高渗、高酸度、防腐剂）完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。无菌：没有活的微生物存在，如无菌操作，无菌空气。化疗：利用具有高度选择毒力，（即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质（抗生素、磺胺类）来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的措施。PhysicalwaysHeatsterilization(includingautoclaveandpasteurization)Radiation(microwaves,UV,X-rays,γ-raysandelectrons)Filtration(depthfilter,membranefilterandnucleationtrack(nucleopore)filter)（一）HeatsterilizationCardinaltemperaturesforgrowthHightemperaturesoveroptimumforgrowthcontrolDenaturationathightemperature-theloseofstructureandabilitytofunctionofmacromolecules（大分子）ProteinsarethemostheatsensitiveamongthefourkindsofmacromoleculesHigherorderstructureswillbeeffectedfirstHeatdenaturationofproteinsFactorsaffectingefficiencyofheatsterilizationPresenceofendospores（芽孢）determinestheheatingprocess-temperatureandtime；Moistheathasbetterpenetratingpowerthandryheat；MicrobialcellsdiemorequicklyatacidicpH；Drycellsandsporesaremoreresistanttoheat；Higherconcentrationsofproteins,sugarsandfatsreduceheatpenetration.一些细菌芽孢干热灭菌所需时间菌名不同温度下的杀死时间（分）120℃130℃140℃150℃160℃170℃180℃炭疽杆菌——18060~1209~90—3肉毒梭菌1206015~602520~2510~155~10产气荚膜梭菌5015~355————破伤风梭菌—20~405~15301251土壤细菌芽孢———18030~9015~6015一些细菌芽孢湿热灭菌所需时间菌名不同温度下的杀死时间（分）100℃105℃110℃115℃120℃125℃130℃134℃炭疽杆菌2~155~10——————枯草杆菌数小时——40————腐败厌氧菌78017041155.6———破伤风梭菌5~905~25——————产气荚膜梭菌5~455~2710~1541———肉毒梭菌300~53040~12032~9010~404~20———一种土壤细菌数小时420120156~304—1.5~10一种嗜热菌—400100~30040~11011~353.9~83.51产孢梭菌1504512—————

1、干热灭菌法火焰灼烧法：直接在火焰上灼烧灭菌。适用范围：接种针（环），试管口，三角瓶口，金属小工具。干热灭菌法烘箱内热空气灭菌法：160℃2h，适用于耐高温器皿。注意：温度不可超过180℃，超过180℃，玻璃器皿上的棉塞及外面包的纸张均会被烤焦着火。由于热空气穿透力弱，灭菌时物品不宜堆放得太紧。降温要缓慢，以免玻璃破裂，待温度＜60℃时，方可打开箱门。2、湿热灭菌法煮沸消毒法：一般用于饮用水的消毒，100℃下煮沸数分钟。间歇灭菌法：适用于不耐热培养基。

80~100℃15~60min室温或37℃过夜巴氏消毒法（Pasteurization）加压灭菌法（Autoclave）培养基彻底灭菌重复三次（1）Pasteurization（巴氏消毒法）Namedafterthegreatmicrobiologist-LouisePasteurKillingofnon-sporeformingbacteriainheatsensitivematerialsRemovalofpathogens（病原体）RemovaloffoodspoilagebacteriaKeepingqualityofthematerialsMilkpasteurizationFlashpasteurization-71oC,15secBulkpasteurization-63-66oC,30min（2）Autoclave（加压蒸汽灭菌法）MoistheatingunderpressurePressure-1.1kg/cm2Temperature-121oCSterilizationtimeundertheseconditions-10-15min(longertimeneededforpenetrationoftheseconditionsintointeriorsofobjects)FactorsaffectingefficiencyofAutoclavingsterilization灭菌物体的含菌量：含菌量↑，灭菌时间↑灭菌对象的pH：pH<6，微生物易死亡；pH6.0~8.0，微生物不易死亡灭菌对象的体积：影响热传导率加热与散热速度灭菌锅内空气排除程度的影响：加压蒸汽灭菌不是靠蒸汽压力，而是靠蒸汽温度，灭菌时要先排尽锅内空气，否则压力表上压力=锅内水蒸汽压力+空气压力↓↓压力表上温度水蒸汽锅内温度高温对培养基成分的影响灭菌物体含菌量的影响芽孢数目和灭菌时间的关系芽孢数/ml在100℃下杀菌时间（分）10000000019750000001650000000142500000012100000081000006pH对灭菌时间的影响

温度芽孢数灭菌时间（分）（℃）（个/ml）pH6.1pH5.3pH5.0pH4.7pH4.5120100008753311510000252512131311010000706535302410010000740720180150150灭菌对象体积的影响不同容量的液体的灭菌时间容器（ml）在121~123℃下所需灭菌时间（分）三角烧瓶5012~1420012~1550017~22100020~25200030~35血清瓶900050~55空气排除度对灭菌温度的影响

压力表读数锅内温度（℃）

kg/cm2磅/英寸2纯蒸汽排除1/2空气不排除空气0.35510994720.7010115105901.0515121

112

1001.40201261181091.75251301241152.1030134128121高温对培养基成分的影响形成沉淀物牛肉膏、蛋白胨、麦芽汁等天然培养基灭菌后，发生沉淀。（一般不影响微生物生长）培养基中含Ca、Mg、Fe、Zn等离子，加热后易形成磷酸盐、碳酸盐沉淀。破坏营养，提高色泽褐变：含糖较高的培养基灭菌后，颜色发生变化，如黄、褐色，一般颜色越深，发酵效果越差。原因：还原糖的羰基与氨基酸或蛋白质的氨基反应→氨基糖（褐色）；部份糖分解→焦糖。改变培养基pH：灭菌后，培养基pH下降0.2~0.3降低培养基浓度：气温低时会增加冷凝水。灭菌温度和时间对营养成分破坏的影响灭菌温度（℃）灭菌时间（分）营养成分的破坏（%）10040099.311030671151550

1204271300.581400.0821500.01<1不同温度下湿热灭菌对糖类的破坏（用旋光法测定）糖类灭菌方法（10%）121℃,15分115.6~118℃,20分113~115.6℃,20分100℃,30分含量破坏含量破坏含量破坏含量破坏%%%%%%%%葡萄糖76.0024.0081.8518.1599.400.6091.988.02乳糖67.9032.1085.7014.3095.274.7381.9018.10麦芽糖83.9616.0484.6815.3286.5413.4678.8421.16蔗糖87.6812.3297.742.2698.651.3596.253.75（二）Filtersterilization（过滤除菌法）Filterwithporessizedlessthan0.22umtostopmicrobialcellsUsedforheatsensitivematerialsCannotremovevirusesorextremelysmallbacteria（三）RadiationsterilizationMicrowaves-microwaveoven,thermaleffectsUltraviolet(UV)-DNAbreakageIonizationradiationSources:X-rays,Gammarays,ElectronsMechanism:ionsandreactivemoleculestodestroymacromolecules（四）ChemicalwaysAgentsthatkillorganismsareoftencalled

cidal

agents

(bacterici