(高清版)GBT 40850-2021 饲料中肠杆菌科的检验方法

饲料中肠杆菌科的检验方法国家标准化管理委员会I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。本文件起草单位：江苏海企长城股份有限公司、中华人民共和国淮安海关、中华人民共和国南京海1饲料中肠杆菌科的检验方法本文件描述了饲料中肠杆菌科检验的平板计数法和MPN计数法。本文件适用于对饲料(含宠物饲料)的检验。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。肠杆菌科Enterobacteriaceae在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。最可能数mostprobablenumber基于泊松分布间接计数方法得到的数值。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BPW:缓冲蛋白胨水(BufferedPeptoneWater)CFU:菌落形成单位(ColonyFormingUnits)EE:肠道菌增菌(EnterobacteriaEnrichment)MPN:最可能数(MostProbableNumber)NA:营养琼脂(NutrientAgar)VRBGA:结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VioletRedBileGlucoseAgar)5培养基或试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。25.4VRBGA:按照A.3执行。5.7革兰氏染色液：按照A.6执行。6.1恒温培养箱：36℃±1℃。6.3均质机。6.4拍打式均质器。6.7显微镜：10倍～100倍。6.13pH计或精密pH试纸。取样制样遵循随机性、代表性的原则，采用无菌操作程序，样品数量不少于500g(mL),需要混合均匀。应在接近原有贮存温度条件下贮存试样，并尽快完成检验。8平板计数法8.1检验流程关键控制环节平板计数法检验流程关键控制环节按照图1进行。325g(mL)试+225ml.BPW,均质10倍稀释系列选择2~3个适直连续梯释度的试样匀液，各取1mL分别加入无菌培养Ⅲ内每皿中领注10ml.~15mI.VRBGA培养基，混匀计数.挑取头型菌落，接和丁NA平板葡萄糖发酵试验氧化虑试验单兰氏染也试验计算肠杆茵科菌落数授告图1平板计数法检验流程关键控制环节8.2试验步骤8.2.1.1易粉碎固体试样：称取25g试样，放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，8000r/min~10000r/min均质1min～2min;或放入盛有225mLBPW的无菌均质袋中，置于拍打式均质器中拍打1min～2min,制成10倍稀释的试样匀液。8.2.1.2不易粉碎固体试样：称取25g以上的试样，装于均质袋中，按照1:9比例加入适量BPW,置于拍打式均质器中拍打1min～2min,制成10倍稀释的试样匀液。8.2.1.3液体试样：用无菌吸管吸取25mL试样放入盛有225mLBPW无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中，置于振荡器中振荡，充分混匀，制成10倍稀释的试样匀液。8.2.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取10倍稀释的试样匀液1mL,沿管壁缓缓注入盛有9mLBPW的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成100倍稀释的试样匀液。8.2.1.5根据对试样污染状况的估计，按照上述操作，依次制成10倍递增系列稀释试样匀液。每递增4GB/T40850—2021稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备试样匀液至试样接种完毕，全过程不得超过8.2.2接种和培养8.2.2.1根据试样的污染情况及不同种类饲料中肠杆菌科的限量要求，选择2～3个适宜的连续稀释度的试样匀液1mL加入到无菌培养皿中，每个稀释度接种2个无菌培养皿。同时，分别吸取1mLBPW加入2个无菌培养皿中做空白对照。8.2.2.2将约10mL～15mL冷却至46℃的VRBGA(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注于培养皿中。小心旋转培养皿，使试样匀液与培养基充分混匀。8.2.2.3待琼脂凝固后，再向其中倾注约5mL的VRBGA培养基覆盖平板表层，以防止蔓延生长并使菌落特征更为明显。8.2.2.4待培养皿中的培养基凝固后，翻转培养皿，置于36℃±1℃培养18h～24h。8.2.3菌落计数和确认8.2.3.1肠杆菌科典型菌落为粉红色至红色或紫色菌落，菌落计数以CFU表示。选取典型菌落数在15CFU～150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板，只计数典型菌落数。8.2.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。8.2.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。8.2.3.4从每个平板上至少挑取5个(小于5个则全选)典型菌落进行确认；如果有不同形态的典型菌落，则每种形态分别至少挑取1个菌落进行确认。8.2.3.5分别将所挑选的每一个菌落，划线于NA平板，36℃±1℃培养18h～24h,挑取平板上的菌落进行典型菌落的确认：a)革兰氏染色试验：将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min,水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗；滴加95%乙醇脱色15s～30s,直至染色液被洗掉，但不要过分脱色、水洗；加沙黄复染液，复染1min,水洗、干燥、镜检；革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。肠b)氧化酶试验：用铂接种环或者铱接种环(不应用镍铬接种环)或玻璃棒挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂的滤纸上，试纸的颜色在10s内变为蓝紫色，判为阳性反应；c)葡萄糖发酵试验：用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落，穿刺于葡萄糖琼脂内，于36℃±1℃培养24h±2h,若试管内的内容物变为黄色，判为阳性反应。8.2.4试验数据处理若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内，则按照下列步骤计算。8.2.4.1.1确证的肠杆菌科菌落数a,按式(1)计算。式中：b——某一平板中A个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数，b≤A;A——某一平板中用于确认试验的菌落数；C——某一平板中典型菌落总数。58.2.4.1.2试样中肠杆菌科菌落数N,按式(2)计算。式中：GB/T40850—2021Za——确证的肠杆菌科菌落数之和；n₁——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);n₂——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);d——稀释因子(第一稀释度)。8.2.4.2低菌落数情况若最低稀释度(包括液体试样原液)平板的典型菌落数均小于15CFU,具有确证的肠杆菌科菌落，则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。若最低稀释度(包括液体试样原液)平板均无菌落生长或典型菌落数均小于15CFU,且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。8.2.4.3特殊情况第一稀释度平板上的典型菌落数均大于150CFU,且有确证的肠杆菌科菌落，以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15CFU～150CFU之间，则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算。若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内，且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。上述各种情况的计算示例参见附录B。8.3结果报告8.3.1菌落数小于100CFU/g(mL)时，以整数报告。8.3.2菌落数大于或等于100CFU/g(mL)时，用10的指数形式来表示，采用两位有效数字，数字修约按“四舍五入”原则进行，报告单位为CFU/g(mL)。8.3.3若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。9MPN计数法9.1检验流程关键控制环节MPN计数法检验流程关键控制环节按照图2进行。625g(25g(mL)试样+225mLBPW,沟质10倍稀释系列选择3个适宜连续稀释变的试样匀液每个稀释度3管，只9管BPW1mLBPW培养物+1mLEE肉汤接种VRBGA平板可疑菌落移和NA平板革兰氏染色试验杏MI²N表报告葡萄糖发酵试验氧化酶试验图2MPN计数法检验流程关键控制环节试验样品处理按照8.2.1进行。根据预估试样的污染情况及相关限量要求，选择适宜的3个连续稀释度的试样匀液，每个稀释度3管，共9管BPW于36℃±1℃培养18h±2h。7从BPW各稀释度培养管中，分别移取1mL培养物，接种于10mLEE肉汤中，36℃±1℃培养24h±2h。用接种环从各EE肉汤管分别取培养物1环，划线接种于VRBGA平板，36℃±1℃培养24h±2h,观察平板上有无典型菌落。9.2.3典型菌落确认典型菌落确认按照8.2.3进行。9.3结果报告只要有1个菌落确认为肠杆菌科，其所代表的EE肉汤管即为肠杆菌科阳性。按照附录C中MPN表查询并报告每克(毫升)试样中肠杆菌科的MPN值。8(规范性)培养基和试剂A.1BPWBPW的成分包括：A.1.2制法瓶225mL,121℃高压灭菌15min。A.2.1成分EE肉汤的成分包括：c)磷酸氢二钠(无水),6.45g;A.2.2制法温，调节pH至7.2±0.2,分装于灭菌的18mm×180mm试管中，每管10mL,不需高压灭菌，5℃±3℃可存放一个月。A.3VRBGAA.3.1成分VRBGA的成分包括：9(或0.6%乙醇溶液5mL);g)结晶紫，0.002g(或0.1%水溶液2mL)。将A.3.1所含成分混合，加热煮沸至完全溶解，放冷至室温，调节pH至7.4±0.2,分装于灭菌的锥形烧瓶中，不需要高压灭菌，用前制备。倾注平板，使用前干燥平板。未干燥的平板5℃±3℃可存放A.4NA平板A.4.1成分NA平板的成分包括：注平板，使用前干燥平板。未干燥的平板于5℃±3℃可存放两周。A.5葡萄糖琼脂A.5.1成分葡萄糖琼脂的成分包括：e)溴甲酚紫，0.015g(或0.4%溴甲酚紫酒精溶液3.75mL);A.5.2制法将A.5.1所含成分混合，加热煮沸，放冷至室温，调节pH至7.0±0.2,分装于15mm×150mm试管，每管约5mL,121℃高压灭菌15min后，试管垂直放置。于5℃±3℃可存放1周。为去除培养基中的氧气，使用前可将葡萄糖琼脂试管置于沸水浴中15min,然后迅速冷却，备用。A.6革兰氏染色液结晶紫染色液的成分包括：A.6.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.6.2革兰氏碘液A.6.2.1成分革兰氏碘液的成分包括：A.6.2.2制法A.6.3.1成分沙黄复染液的成分包括：A.6.3.2制法A.7氧化酶试剂A.7.1成分氧化酶试剂的成分包括：A.7.2制法将N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐溶解于冷水中，少量新鲜配制。GB/T40850—2021(资料性)结果计算示例B.1两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板，并含有已确证的肠杆菌科菌落，数据见表B.1。表B.1肠杆菌科平板计数结果示例1稀释度1:100(第一稀释度)1:1000(第二稀释度)典型菌落数/CFU用于确认试验的菌落数/CFU5555确证的菌落数/CFU3554a3/5×134=805/5×147=1475/5×18=184/5×22=18上述数据按8.3.2数字修约后，表示为12000或1.2×10¹。B.2两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内，或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内，则相应的平板不作为计数平板，数据见表B.2。表B.2肠杆菌科平板计数结果示例2稀释度1:100(第一稀释度)1:1000(第二稀释度)典型菌落数/CFU用于确认试验的菌落数/CFU555确证的菌落数/CFU453a4/5×138=1105/5×124=1243/5×18=11—上述数据按8.3.2数字修约后，表示为12000或1.2×10⁴。B.3两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中一个平板无已确证的肠杆菌科菌落，则相应的平板不作为计数平板，数据见表B.3。表B.3肠杆菌科平板计数结果示例3稀释度1:100(第一稀释度)用于确认试验的菌落数/CFU5555确证的菌落数/CFU4540a4/5×138=1105/5×124=1244/5×18=140上述数据按8.3.2