基因组编辑的脱靶效应

1/1基因组编辑的脱靶效应第一部分基因组编辑脱靶效应概述 2第二部分脱靶效应产生的分子机制 4第三部分脱靶效应的主要检测方法 6第四部分脱靶效应评估的生物学影响 8第五部分影响脱靶效应发生的因素 11第六部分降低脱靶效应的策略 14第七部分脱靶效应对基因组编辑安全的意义 17第八部分脱靶效应在生物医学研究的应用前景 19

第一部分基因组编辑脱靶效应概述基因组编辑脱靶效应概述

基因组编辑，特别是利用CRISPR-Cas系统，已成为一种强大的工具，用于对生物体中的基因组进行精确修改。然而，这种技术也存在着脱靶效应的风险，这可能导致基因组未预期的修改。

脱靶效应是指CRISPR-Cas系统错误地识别和剪切与靶序列相似的非靶位点。其发生率和严重程度取决于CRISPR组件的设计和优化方式。

脱靶效应的机制

脱靶效应的机制与CRISPR-Cas系统中sgRNA和Cas蛋白的序列特异性有关。sgRNA是引导Cas蛋白识别和切割靶序列的RNA分子。如果sgRNA具有与非靶位点相似的序列，Cas蛋白就有可能错误地识别并剪切非靶位点。

脱靶效应的类型

脱靶效应可分为以下几类：

*插入/缺失(INDEL)：Cas蛋白剪切非靶位点后，可能会导致INDEL，从而改变基因序列。

*单碱基替换：Cas蛋白可能会在非靶位点附近引入单碱基替换，导致点突变。

*染色体易位：Cas蛋白剪切两个不同染色体上的非靶位点，可能导致染色体易位。

脱靶效应的评估

评估基因组编辑中的脱靶效应至关重要，以确保安全性和有效性。有几种技术可用于检测脱靶效应，包括：

*体外核酸酶剪切试验(T7E1)：T7E1是一种核酸酶，它可识别并剪切含有错配的DNA。通过使用T7E1处理编辑后的基因组，可以检测到脱靶效应。

*高通量测序：高通量测序技术，如全基因组测序(WGS)和全外显子组测序(WES)，可用于识别编辑位点和脱靶位点。

*荧光原位杂交(FISH)：FISH使用荧光探针检测特定DNA序列的位置。FISH可用于可视化脱靶编辑事件。

脱靶效应的最小化策略

有几种策略可用于最小化基因组编辑中的脱靶效应，包括：

*优化sgRNA设计：选择高度特异性的sgRNA，避免具有相似序列的脱靶位点。

*使用Cas9变体：一些Cas9变体，如Cas9nickase和eCas9，具有更高的序列特异性，从而降低脱靶效应的风险。

*使用多个sgRNA：同时使用多个靶向不同位置的sgRNA可以提高编辑效率并降低脱靶效应。

*进行靶向验证：在进行基因组编辑之前，使用T7E1或高通量测序等技术验证sgRNA的特异性。

总结

脱靶效应是基因组编辑中的一项潜在风险，可能导致基因组未预期的修改。通过了解脱靶效应的机制、评估方法和最小化策略，可以提高基因组编辑的安全性、特异性和有效性。第二部分脱靶效应产生的分子机制关键词关键要点脱靶效应产生的分子机制

错误的DNA识别和切割：

1.基因组编辑系统可能识别和切割非靶标序列，这可能是由于序列相似性或其他因素导致的。

2.导致错误识别的机制包括：核酸酶的非特异性切割活性、PAM序列的错配、以及染色质结构的变化。

非特异性核酸酶活性：

脱靶效应的分子机制

DNA双链断裂修复途径

*非同源末端连接(NHEJ)：一种快速的、误差易发的修复机制，直接连接断裂的DNA末端，可能导致碱基插入或缺失。

*同源重组(HR)：一种较慢但更精确的修复机制，利用模板DNA来指导修复，但可能发生交叉修复，导致脱靶效应。

Cas9介导的脱靶效应

*PAM序列相似性：Cas9识别目标DNA上的PAM序列。具有相似PAM的脱靶位点可能被Cas9识别，导致切割。

*引导RNA(gRNA)：gRNA与靶DNA杂交，引导Cas9到正确位置。gRNA序列与脱靶位点有部分匹配可能导致杂交和切割。

碱基编辑器介导的脱靶效应

*碱基编辑器3(BE3)：碱基编辑器通过将胞嘧啶转化为尿嘧啶来编辑DNA。脱靶效应可能由碱基配对错误或非目标胞嘧啶转化引起。

*碱基编辑器7(BE7)：BE7将腺嘌呤转化为鸟嘌呤。脱靶效应可能由腺嘌呤配对错误或非目标腺嘌呤转化引起。

影响脱靶效应的因素

*gRNA序列设计：仔细设计gRNA序列对于最小化脱靶效应至关重要。选择特异性高，脱靶效应低的gRNA。

*Cas9变异体：开发了Cas9变异体以减少脱靶效应，例如nickaseCas9、Cas9n和eCas9。

*靶点可及性：靶点附近的染色质结构会影响Cas9的进入和切割效率。

*细胞类型：不同细胞类型对脱靶效应的敏感性不同。

*修复机制：HR能力较强的细胞不太可能发生脱靶效应。

检测脱靶效应的方法

*SITE-Seq：一种用于检测基因组范围内Cas9切割位点的文库制备技术。

*GUIDE-Seq：一种用于检测脱靶效应gRNA序列的文库制备技术。

*BLESS：一种用于检测碱基编辑器脱靶效应的文库制备技术。

减少脱靶效应的策略

*优化gRNA选择：使用软件工具和算法来识别特异性高的gRNA。

*使用特异性Cas9变异体：nickaseCas9、Cas9n和eCas9等变异体可减少脱靶切割。

*优化递送方法：脂质体和病毒载体等递送方法会影响脱靶效应。

*使用靶向改善方法：CRISPR激活和抑制方法可减少脱靶效应。

*修复机制调节：HR修复能力可以通过化学抑制剂或转基因技术来加强。第三部分脱靶效应的主要检测方法关键词关键要点DNA测序技术

1.全基因组测序（WGS）：对整个基因组进行测序，识别脱靶位点。

2.外显子组测序(WES)：仅对基因编码区域进行测序，覆盖率高，成本较低。

3.定向测序：设计引物针对特定脱靶基因区域进行测序，灵敏度高。

生物信息学分析

脱靶效应的主要检测方法

基因组编辑技术在生物医学研究和临床应用中具有巨大潜力，然而，脱靶效应仍然是该技术面临的主要挑战之一。脱靶效应是指编辑器无意中切割基因组中编辑目标位点以外的区域。了解脱靶效应的发生频率和谱系至关重要，以评估基因组编辑疗法的安全性和准确性。

体外检测方法

*循环末端测序(Deepsequencing)：这是检测脱靶效应最常见的方法。它涉及扩增编辑目标位点周围的区域并对扩增子进行高通量测序。通过将测序读数与参考基因组进行比对，可以识别编辑目标位点外的编辑。

*T7内切酶I错配分析(T7E1)：该方法利用T7内切酶I检测脱靶效应，T7内切酶I是一种识别和切割错配碱基的酶。它在编辑后的DNA上孵育，会切割编辑过程中产生的脱靶错配碱基。

*PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性)：该方法利用限制性内切酶检测脱靶效应，限制性内切酶是一种识别并切割特定DNA序列的酶。它在编辑后的DNA上孵育，如果发生了脱靶编辑，限制性内切酶的切割模式会发生变化，从而产生不同的片段长度。

体内检测方法

*IDLV（整合前DNA探针链）测序：该方法利用插入突变验证载体(IDLV)对脱靶效应进行体内检测。IDLV是一种载体，包含一个随机条形码序列，该序列在基因组编辑过程中插入到编辑位点。通过对整合到基因组的条形码序列进行测序，可以识别脱靶编辑事件。

*Digenome-seq：该方法是一种高通量测序技术，可以同时检测基因组编辑的脱靶效应和插入突变。它涉及从编辑细胞中提取DNA并使用长读长测序平台对DNA进行测序。通过将测序读数与参考基因组进行比对，可以识别脱靶编辑和插入突变。

*GUIDE-seq：该方法是一种基于CRISPR的方法，用于检测脱靶效应。它利用CRISPR-Cas9结合脱靶位点，然后进行逆转录和扩增。通过对扩增子的测序，可以识别脱靶编辑事件。

评估脱靶效应的考虑因素

*灵敏度和特异性：检测方法的灵敏度是指其检测脱靶效应的能力，特异性是指其区分真脱靶效应和假阳性结果的能力。

*通量：检测方法的通量是指其同时检测多个样品的能力。

*成本：检测方法的成本是一个重要的考虑因素，因为它可能会影响其广泛使用。

*易用性：检测方法的易用性至关重要，因为它决定了其在实验室中的可行性。

正在开发的新检测方法

除了上述方法外，还有一些新的脱靶效应检测方法正在开发中，包括：

*Cas9二聚体化检测：该方法利用CRISPR-Cas9结合脱靶位点的能力和Cas9蛋白的二聚化性质。通过检测二聚化Cas9，可以识别脱靶编辑事件。

*Nanopore测序：该方法利用纳米孔测序技术的单分子读长和快速的特点来检测脱靶效应。

*CRISPR阵列：该方法利用CRISPR阵列来检测脱靶效应。通过将CRISPR阵列设计成靶向潜在脱靶位点，可以识别脱靶编辑事件。

结论

脱靶效应是基因组编辑技术面临的主要挑战之一。了解脱靶效应的发生频率和谱系至关重要，以评估基因组编辑疗法的安全性和准确性。通过使用各种体外和体内检测方法，研究人员可以全面评估脱靶效应，并采取措施将其最小化或消除。正在开发的新检测方法有望进一步提高检测灵敏度和通量，从而为基因组编辑的更安全和有效的应用铺平道路。第四部分脱靶效应评估的生物学影响关键词关键要点主题名称：基因表达调控的改变

1.脱靶效应可能会干扰基因表达的调控，导致基因过表达或表达抑制。

2.脱靶效应可能会改变转录因子结合位点或调控元件，影响基因表达的模式和时间。

3.脱靶效应可能会干扰非编码RNA（如miRNA）的表达，从而间接影响其他基因的表达。

主题名称：染色质结构的改变

基因组编辑的脱靶效应：生物学影响评估

导言

基因组编辑技术的兴起引发了对脱靶效应的担忧。脱靶效应是指基因组编辑工具意外修改目标基因组以外的位点。了解脱靶效应的生物学影响对于评估基因组编辑技术的安全性至关重要。

脱靶效应评估

评估脱靶效应的方法包括：

*靶向富集测序(TGS)：使用测序技术识别基因组中被切割的位点。

*脱靶克隆分析(OCA)：扩增并克隆潜在的脱靶位点，然后进行测序。

*脱靶GUIDE-seq(GUIDE-seq)：使用GUIDE-seq技术在全基因组范围内识别脱靶位点。

脱靶效应的类型

脱靶效应可分为两类：

*插入/缺失突变(Indel)：由Cas9蛋白的切割活动引起，可导致基因组插入或缺失。

*碱基替换突变：由Cas9蛋白在不对称底物位点切割引起，导致碱基配对错误。

生物学影响

脱靶效应的生物学影响取决于：

*脱靶位点的功能：脱靶效应可能会影响基因表达、蛋白质功能或调控元件。

*突变的类型：插入/缺失突变比碱基替换突变更可能导致严重后果。

*突变的发生率：脱靶效应的频率越高，生物学影响就越显著。

已知的生物学影响

脱靶效应的已知生物学影响包括：

*细胞毒性：高水平的脱靶效应可导致细胞损伤和死亡。

*非预期基因表达变化：脱靶效应可激活或抑制非目标基因的表达。

*癌症：脱靶效应可通过激活癌基因或抑制抑癌基因来促进癌症的发生。

*发育异常：胚胎发育期间的脱靶效应可导致严重的畸形。

*遗传性疾病：生殖细胞中的脱靶效应可遗传给后代，并导致遗传性疾病。

影响因素

脱靶效应的发生率和生物学影响受以下因素影响：

*基因编辑工具：不同类型的工具（如Cas9、Cas12a）具有不同的脱靶活性。

*靶向策略：靶向序列的选择和设计可以影响脱靶活性。

*细胞类型：不同细胞类型的染色质结构和修复机制可以影响脱靶效应。

*给药方式：基因编辑工具的给药方式（如病毒载体、脂质体）可以影响脱靶活性。

减轻脱靶效应

为了减轻脱靶效应，可以使用以下策略：

*优化靶向策略：使用计算工具和实验验证来选择脱靶活性低的靶向序列。

*使用高保真基因编辑工具：开发出具有更高保真度的基因编辑工具，以减少脱靶活性。

*脱靶筛选：在应用基因组编辑之前进行脱靶筛选，以识别和去除具有高脱靶活性的细胞株。

*体内脱靶监控：使用分子生物学工具或测序技术在体内监测脱靶效应。

结论

脱靶效应是基因组编辑技术的潜在风险，了解其生物学影响对于评估其安全性和伦理性至关重要。通过优化靶向策略、使用高保真工具和进行脱靶筛选，可以减轻脱靶效应，从而提高基因组编辑技术的安全性。持续的研究和发展对于进一步阐明脱靶效应的生物学影响并制定安全有效的基因组编辑策略至关重要。第五部分影响脱靶效应发生的因素关键词关键要点【脱靶效应的位点相关性】：

1.脱靶效应的频率与靶基因的序列特征相关，如GC含量、重复序列和DNA结构。

2.高GC含量和富含重复序列的基因位点更容易发生脱靶编辑，因为这些位点对Cas9的结合和切割更有利。

3.DNA结构，如发夹结构或Z-DNA，也会影响Cas9的结合和切割效率，从而影响脱靶效应的发生。

【脱靶效应的系统相关性】：

影响脱靶效应发生的因素

基因组编辑技术，如CRISPR-Cas9，通过靶向特定的DNA序列来实现对基因组的精确修饰。然而，脱靶效应，即在非靶向位点发生编辑，是基因组编辑中一个日益受到关注的问题。

影响脱靶效应发生的因素包括：

1.靶向RNA的设计：

*靶向序列的长度：较长的靶向序列（通常为20个以上碱基）提供了更高的特异性，从而减少脱靶效应。

*碱基序列的组成：GC含量高的靶向序列比AT含量高的靶向序列具有更高的亲和力，从而降低了脱靶编辑的风险。

*错配容忍度：Cas9对靶向序列的错配具有耐受性，但耐受程度因PAM序列和Cas9突变体而异。错配耐受度越高，脱靶效应的风险也越高。

2.Cas9核酸酶：

*Cas9浓度：高浓度的Cas9核酸酶可导致脱靶编辑的增加。

*Cas9突变体：工程化Cas9突变体（如dCas9、nCas9）具有更高的特异性，从而降低脱靶效应。

*PAM序列：PAM序列（靶向RNA结合位点的相邻区域）的类型和频率影响脱靶编辑的风险。

3.供体模板：

*供体模板的长度：长的供体模板可导致同源重组介导的脱靶插入。

*供体模板的序列相似性：供体模板与非靶向位点具有高序列相似性可引发脱靶重组。

*供体模板的结构：供体模板的二级结构（如发卡环和假结）可影响同源重组的效率和脱靶效应的发生。

4.细胞背景：

*细胞类型：不同类型的细胞具有不同的DNA修复机制，这会影响脱靶编辑的频率。

*细胞周期：Cas9核酸酶在S期表现出更高的活性，因此该期间进行编辑会增加脱靶效应的风险。

*表观遗传修饰：DNA甲基化和组蛋白修饰可影响Cas9的结合和切割活性，从而导致脱靶编辑。

5.筛选策略：

*筛选方法：使用高通量测序或其他高灵敏度方法进行脱靶分析至关重要。

*脱靶分析深度：分析的深度应足够，以检测低频脱靶事件。

*筛选时间点：在编辑后不同时间点进行脱靶分析可识别累积的脱靶效应。

6.生物信息学工具：

*脱靶预测工具：这些工具利用机器学习算法预测脱靶编辑的可能性。

*序列比对软件：用于识别靶向序列与非靶向序列之间的相似性。

*基因组注释数据库：用于识别脱靶编辑可能影响的基因和调控元件。

7.其他因素：

*CRISPR级联反应：Cas9介导的切割可形成双链断裂，引发CRISPR级联反应，导致旁观者DNA的编辑。

*非同源末端连接：DNA双链断裂的非同源末端连接可导致插入或缺失，从而产生脱靶突变。

*错误修复机制：某些类型的细胞具有高效的错误修复机制，可降低脱靶效应的频率。

通过全面考虑这些因素并实施适当的预防措施，研究人员可以最大限度地减少基因组编辑中的脱靶效应，从而确保该技术的安全和准确应用。第六部分降低脱靶效应的策略关键词关键要点主题名称：CRISPR-Cas9系统优化

1.工程改造Cas9蛋白，引入高特异性突变体，如Cas9-H840A、Cas9-D10A和Cas9-SFF（superFFL），降低其脱靶活性。

2.开发新型核酸酶，如Cas13a和Cpf1，它们具有不同的靶向机制和脱靶特性，为选择低脱靶编辑器提供更广泛的选择。

3.使用向导RNA（gRNA）修饰，例如引入插入、缺失或化学修饰，优化gRNA-DNA结合特异性，从而减少脱靶效应。

主题名称：非CRISPR基因编辑系统

降低脱靶效应的策略

为最大程度降低基因组编辑的脱靶效应，研究人员已开发出多种策略。这些策略主要集中于对编辑机制的改进、靶向工具的优化以及脱靶检测和修复方法的开发。

编辑机制的改进

*Cas9nickase：仅切断目标DNA链条的一条，而不是双链断裂，从而降低脱靶效应。

*引导RNA工程：对引导RNA序列进行修改，减少其与脱靶位点的结合。

*碱基编辑器：不引入双链断裂，而是直接编辑目标DNA碱基，进一步降低脱靶效应。

靶向工具的优化

*单个导向RNA（sgRNA）：使用单个sgRNA靶向特定DNA序列，从而减少脱靶效应。

*双sgRNA：使用两个sgRNA同时靶向目标DNA序列，提高特异性并减少脱靶。

*sgRNA优化：对sgRNA序列进行计算机建模和筛选，选择脱靶效应最小的sgRNA。

脱靶检测和修复方法

*PCR扩增和测序：对靶向区域进行PCR扩增和测序，检测脱靶效应。

*高通量测序：通过全基因组测序或外显子组测序鉴定脱靶位点。

*脱靶修复：使用诸如同源重组或基因编辑的策略来修复脱靶引起的突变。

以下是这些策略的具体数据和研究结果：

*Cas9nickase：研究表明，Cas9nickase可将脱靶效应降低高达100倍。

*引导RNA工程：对引导RNA序列进行修改已显示出脱靶效应降低2-3倍。

*单个sgRNA：使用单个sgRNA靶向特定的DNA序列可将脱靶效应降低高达50%。

*PCR扩增和测序：PCR扩增和测序已成功检测到低至0.1%的脱靶效应。

*高通量测序：全基因组测序已用于鉴定脱靶位点，准确度高达99%。

这些降低脱靶效应的策略对基因组编辑的安全性至关重要。它们使研究人员能够更加精确地靶向特定DNA序列，从而最大程度降低对基因组其他区域的意外编辑。

参考文献

*Jinek,M.，Chylinski,K.，Fonfara,I.，Hauri,M.，Doudna,J.A.，&Charpentier,E.（2012）。一个可编程的分子剪刀：Cas9。科学，337（6096），816-821。

*Cong,L.，Ran,F.A.，Cox,D.，Lin,S.，Barretto,R.，Habib,N.，...张，F.（2013）。一种多用途的CRISPR-Cas9系统用于哺乳动物基因组工程。自然协议，8（11），2213-2222。

*Mali,P.，Aach,J.，Stranges,P.B.，Ramirez,C.L.，Mahaney,R.E.，Deo,S.，...Church,G.M.（2013）。RNA引导的人工核酸酶CRISPR-Cas9在哺乳动物细胞中的基因组靶向。自然生物技术，31（9），833-838。

*Shalem,O.，Sanjana,N.E.，Hartenian,E.，Shi，X.，Scott,D.A.，Mikkelson,T.，...张，F.（2014）。全基因组CRISPR-Cas9筛选识别癌基因。科学，343（6165），84-87。第七部分脱靶效应对基因组编辑安全的意义关键词关键要点脱靶效应对基因组编辑安全的意义

脱靶效应与癌症风险

1.脱靶效应可能导致基因组的不稳定，增加致癌突变的风险。

2.某些基因座的脱靶效应与特定的癌症类型有关，例如白血病和肝癌。

3.准确检测脱靶效应至关重要，以评估基因组编辑疗法的癌症风险。

脱靶效应与生殖毒性

基因组编辑的脱靶效应对基因组编辑安全的意义

引言

基因组编辑技术，例如CRISPR-Cas9，具有强大的基因组改造能力，可用于治疗遗传疾病、提高作物产量和开发新疗法。然而，这些技术的脱靶效应，即意外改变目标基因以外的基因序列，对基因组编辑的安全性提出了重大挑战。

脱靶效应的发生率

脱靶效应的发生率因使用的基因组编辑方法、目标基因和细胞类型而异。CRISPR-Cas9的脱靶效应发生率约为0.1%至1%，而其他方法如TALEN和锌指核酸酶的脱靶效应发生率更高。

脱靶效应的潜在影响

脱靶效应可导致一系列有害后果，包括：

*基因组不稳定性：脱靶效应可引入基因组中的有害突变，从而导致癌症、神经退行性疾病和其他疾病。

*功能丧失：脱靶效应可破坏关键基因的正常功能，从而导致表型异常或疾病。

*非预期调节：脱靶效应可改变基因表达模式，导致不希望的生物学效应。

评估脱靶效应

评估脱靶效应对于确保基因组编辑技术的安全至关重要。可使用以下方法来检测脱靶效应：

*全基因组测序：通过比较编辑后的基因组与未编辑的参考基因组，可以识别基因组中的所有突变，包括脱靶效应。

*靶标外测序：通过测序已知脱靶位点的序列，可以检测特定位点是否存在脱靶效应。

*细胞功能分析：通过评估编辑后细胞的表型，可以检测脱靶效应是否导致功能改变。

减轻脱靶效应

通过以下方法可以减轻脱靶效应：

*优化引导RNA设计：通过选择高度特异性的引导RNA，可以最大限度地减少脱靶效应的发生率。

*使用高保真酶：高保真基因组编辑酶可特异性结合目标序列，从而减少脱靶效应。

*采用多重编辑策略：通过使用多个靶向不同位点的引导RNA，可以降低任何单一脱靶效应的可能性。

监管考虑

由于脱靶效应对基因组编辑安全的潜在影响，监管机构正在制定指南和法规来确保这些技术的安全使用。这些指南包括要求对脱靶效应进行全面评估，并建立监测脱靶效应长期影响的机制。

结论

脱靶效应是基因组编辑技术中一个重大的安全问题，需要仔细评估和减轻。通过优化方法、采用多重编辑策略和实施严格的监管指南，我们可以降低脱靶效应的风险，并确保基因组编辑技术的安全使用。第八部分脱靶效应在生物医学研究的应用前景关键词关键要点脱靶效应在生物医学研究的应用前景

主题名称：基因组调控与疾病建模

1.脱靶效应可识别基因组中对疾病敏感的调控元件，例如增强子和启动子。

2.通过微调脱靶效应，研究人员可以控制基因表达，并建立疾病的细胞和动物模型。

3.这些模型可用于研究疾病机制，开发新疗法，并进行药物筛选。

主题名称：表观遗传修饰研究

脱靶效应在生物医学研究的应用前景

脱靶效应是指基因组编辑工具意外地靶向和修改非目标位点。虽然脱靶效应在基因组编辑的应用中是一个潜在的担忧，但其也为生物医学研究提供了独特的机会。

1.研究基因功能

脱靶效应可用于识别和表征基因功能。通过在目标基因附近的不同位置引入脱靶突变，研究人员可以确定哪些区域对于基因功能至关重要。这种方法被称为“反义筛选”，已被用于研究包括癌症和神经退行性疾病在内的各种疾病中基因的功能。

2.开发新的治疗策略

脱靶效应可用于开发针对特定疾病的新型治疗策略。例如，在癌症治疗中，脱靶效应可用于靶向肿瘤细胞中多个位点，从而增加治疗的有效性并减少耐药性的产生。

3.改善基因编辑技术

研究脱靶效应有助于改进基因编辑技术的安全性。通过了解脱靶效应的机制，研究人员可以开发出策略来最大限度地减少脱靶事件的发生，从而提高基因编辑技术的精度。

脱靶效应应用的具体案例

以下是脱靶效应在生物医学研究中应用的几个具体案例：

*反义筛选：研究人员使用CRISPR-Cas9在小鼠中进行反义筛选，以识别与自闭症谱系障碍相关的基因。他们发现了几个脱靶突变位点，这些位点与