地中海贫血基因诊断项目开展指南

α-地中海贫血基因诊断项目开展指南一α-地中海贫血基因诊断流程示意图二实验室建设1最佳α-地中海贫血基因诊断实验室设计平面图1）实验室应具有试剂准备区、标本制备区、PCR扩增区及产物分析区（如上图）2）临床样本的收取及储存应该在这4个区域以外的地方完成。3）进入各个工作区必须遵循严格的单一方向顺序。4）进入各工作区必须严格按照要求更换各区域特定颜色的工作服，并同时佩戴一次性手套。出工作区之前必须脱去区域特定工作服及手套。5）每一个工作区都应有独立的一套仪器设备及耗材（包括移液器、离心机、试管架、一次性手套、移液吸头、离心管及冰箱等），且不同区域的仪器设备及耗材不能混用。2实验室环境1）工作区域必须始终保持清洁整齐2）所有实验台面及地面均应保持清洁.3）所有实验废料及垃圾使用专用垃圾袋装好后，封口处理。4）每次工作前后对工作台面进行消毒液擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后开启紫外灯进行灭菌。3实验室制度及人员配备1）实验室必须有完整详细的操作规章制度并严格遵守。2）操作人员需要一定的专业技术知识和经验。3）操作人员需要有强烈的责任感，且工作认真细心。4）操作人员需要严格遵守α-地贫基因诊断的操作规程。三实验所需试剂、设备及其功能简介α-地中海贫血基因诊断实验主要由以下三个实验组成：全血或羊水DNA的抽提，基因扩增（PCR），电泳分析。1实验所需试剂名称目的提供试剂自备试剂全血或羊水DNA的抽提提取DNA全血DNA快速提取试剂盒无水乙醇基因扩增用于扩增DNA样本PCR反应液（-18℃无电泳检测分析分析各PCR扩增产物无电泳缓冲液、核酸染料、琼脂糖、上样缓冲液等2实验所需仪器（推荐使用）及功能简介实验所需试剂所需仪器及部分耗材功能简介全血或羊水DNA的抽提使用全血或羊水DNA抽提试剂盒台式高速离心机转速要求13,000rpm将细胞与细胞保存液分开超净工作台为实验操作提供一个洁净，安全的操作环境。真空旋转干燥仪干燥沉淀微量移液器0.5-10µL，10-100µL,100-1000µL（专用）微量加样和移液1.5mL离心管（已灭菌）及管架（专用）已灭菌移液吸头（与移液器配套）（专用）旋涡振荡器转速：2800rpm悬浮沉淀工作服及一次性手套（专用）保护操作人员同时防止实验污染冰盒维持PCR反应液的低温要求，避免PCR试剂因为温度的变化而对实验结果的影响。冰箱（-20℃，4℃）存放采集的样本及已抽提好的DNA样本记号笔，计时器等对不同样本进行编号及计时全血或羊水细胞DNA扩增PCR反应液普通PCR仪样本DNA在短时间里指数性的增长。电泳检测电泳试剂电泳系统（电泳仪和电泳槽）电泳分离不同大小的DNA片段微波炉快速加热液体微量移液器一套（0.5-10,10-100µL,100-1000µL）（专用）微量加样和移液紫外透射分析仪（或凝胶成像系统）观察电泳凝胶中已分离的DNA片段电子天平/托盘天平准确称量微量物质移液吸头（与移液器配套）（已灭菌,专用）和移液器配套使用，量取不同体积的液体试剂。冰箱4℃放置电泳试剂工作服及一次性手套保护操作人员同时防止实验污染记号笔及计时器等对不同样本进行编号及计时胶床，胶带纸，Parafilm膜，锥形瓶，锡纸，药匙，厚手套，1.5mL离心管架，50mL量筒等β-地中海贫血基因诊断项目开展指南一β－地中海贫血基因诊断实验工作流程二实验室建设1最佳β-地中海贫血基因诊断实验室设计平面图1）实验室应具有试剂准备区、标本制备区、PCR扩增区及产物分析区（如上图）2）临床样本的收取及储存应该在这4个区域以外的地方完成。3）进入各个工作区必须遵循严格的单一方向顺序。4）进入各工作区必须严格按照要求更换各区域特定颜色的工作服，并同时佩戴一次性手套,出工作区之前必须脱去区域特定工作服及手套。5）每一个工作区都应有独立的一套仪器设备及耗材（包括移液器、离心机、试管架、一次性手套、移液器吸头、离心管及冰箱等），且不同区域的仪器设备及耗材不能混用。2实验室环境1）工作区域必须始终保持清洁整齐2）所有实验台面及地面均应保持清洁.3）所有实验废料及垃圾使用专用垃圾袋装好后，封口处理。4）每次工作前后对工作台面进行消毒液擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后开启紫外灯灭菌。3实验室制度及人员配备1）实验室必须有完整详细的操作规章制度并严格遵守。2）操作人员需要一定的专业技术知识和经验。3）操作人员需要有强烈的责任感，且工作认真细心。4）操作人员需要严格遵守β-地贫基因诊断的操作规程进行实验操作。三实验所需试剂、设备及其功能简介β-地中海贫血基因诊断检测实验主要由以下三个实验组成：全血DNA的抽提，基因扩增（PCR），杂交分析。1实验所需试剂名称用途备注全血DNA快速提取试剂盒提取DNA全血DNA的抽提试剂盒Ⅰ用于扩增DNA样本PCR反应液（-18℃试剂盒Ⅱ杂交检测PCR扩增产物杂交试剂盒（2~8℃保存）2实验所需仪器（推荐使用）及功能简介实验所需试剂所需仪器及部分耗材功能简介全血DNA的抽提使用全血DNA抽提试剂盒台式高速离心机转速要求：13,000rpm将细胞与细胞保存液分开超净工作台为实验操作提供一个洁净，安全的操作环境真空旋转干燥仪干燥沉淀微量移液器0.5-10µL，10-100µL,100-1000µL（专用）微量加样和移液1.5mL离心管（已灭菌）及管架（专用）已灭菌移液吸头（与移液器配套）（专用）旋涡振荡器转速：2800rpm悬浮沉淀工作服及一次性手套（专用）保护操作人员同时防止实验污染冰盒维持PCR反应液的低温要求，避免PCR反应液因为温度的变化对实验的影响。冰箱（-20℃，4℃）存放采集的样本及已抽提好的DNA样本记号笔，计时器等对不同样本进行编号及计时全血细胞DNA扩增PCR反应液普通PCR仪样本DNA在短时间里几何级数增长。β-地贫芯片杂交杂交试剂盒杂交仪型号：FINEPCRCombi-H12参数：温度范围：约5℃～控温精度：±0.5旋转速度：0～40rpm核酸分子杂交电磁炉或恒温水浴锅水浴加热，使双链DNA变性成为单链微量移液器一套（0.5-10,10-100µL,100-1000µL）（专用）微量加样和移液移液吸头（与移液器配套）（已灭菌,专用）和移液器配套使用，量取不同体积的液体试剂。工作服及一次性手套保护操作人员，同时防止实验污染记号笔及计时器等对不同样本进行编号及计时玻璃器材:量筒（100mL，1000mL），烧杯，移液管，吸耳球，镊子，显色盒，孵育盒，封口袋，离心管及离心管架（1.5mL）（专用）临床检测结果及常见问题解答1α-地中海贫血基因诊断的方法主要有哪些？1）Southern印迹杂交Southern杂交是早期使用的方法，但该法耗时、操作繁琐，不宜作为常规方法使用。2）限制性酶切分析法基因突变导致基因产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失，用限制性酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在。3）聚合酶链式反应（PCR）法以聚合酶链反应（PCR）为基础的各种方法现已广泛应用于α-地中海贫血的基因诊断，如以跨跃断裂点PCR（GAP－PCR）为基础的多重PCR方法等。2β-地中海贫血基因诊断方法主要有哪些？1）PCR-限制酶切法用PCR方法扩增患者基因组中含突变位点的珠蛋白基因片段,再选择适当的内切酶消化PCR产物,电泳后根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断。2）聚合酶链反应结合寡核苷酸探针杂交（PCR-ASO）将β-珠蛋白基因的PCR扩增产物经碱变性后，固定于尼龙膜或硝酸纤维素膜上，与特异寡核苷酸探针（ASO）进行杂交。但该法一次检测只针对一种突变，所以费时费力，限制了该方法的应用。3）基因芯片检测技术（PCR+反向点杂交）将β-地贫突变区域的DNA片段进行PCR扩增，然后将扩增产物与固定在玻片或尼龙膜上一系列探针进行杂交，激发荧光或显色后扫描杂交结果，可确定患者β-珠蛋白基因是否发生突变以及突变的具体类型。是目前公认的准确、可靠、快捷的β-地中海贫血基因诊断和产前诊断方法。3地中海贫血基因诊断有何意义？1）地中海贫血基因诊断可在临床上对患者的基因型进行确诊，对家族成员基因型进行追踪及监控。2）应用于婚前检查、产前诊断，预防以及减少重症地中海贫血儿的出生，降低地中海贫血发生率，提高人口素质。4地中海贫血基因诊断技术有何优点？α－地中海贫血基因诊断采用跨跃断裂点PCR为基础的多重PCR技术和电泳技术，可快速、准确地同时检测人临床全血或羊水样本中α珠蛋白基因上--SEA、-α3.7和-α4.2基因位点的缺失，已广泛应用于α-地中海贫血的临床诊断、产前筛查等。β－地中海贫血基因诊断技术采用先进的PCR技术结合DNA芯片杂交技术，是目前国内检测β-珠蛋白基因突变位点最多的芯片系统。该方法可快速、准确检测人全血或羊水样本中β-珠蛋白基因上17个位点（8个常见位点及9个少见位点）突变，并确定具体的基因突变类型，为β-地中海贫血的临床诊断、携带者检出提供重要的参考依据。5什么情况下需要进行地中海贫血基因诊断？临床贫血患者在医生指导下检测。地中海贫血高危区人群（如中国华南、西南等省市）婚前地中海贫血检查。夫妇婚检确诊或怀疑为地贫患者或携带者，怀孕后尽早进行产前诊断。6地中海贫血基因突变检出后如何办？轻型地中海贫血无需特殊治疗，中间型和重型地中海贫血目前还没有方便可行的治疗方案，可采取下列一种或数种方法给予治疗。

1）一般治疗注意休息和营养，适当补充叶酸和维生素E。

2）输血和去铁治疗

一般采用红细胞输注和铁鳌合剂联合治疗，是目前重要治疗方法之一。

3）脾切除

脾切除对血红蛋白H病和中间型β地中海贫血的疗效较好，对重型β地中海贫血效果较差。

4）造血干细胞移植

造血干细胞移植是目前能根治重型β地中海贫血的方法。如有HLA相配的造血干细胞供者，应作为治疗重型β地中海贫血的首选方法。

5）基因活化治疗

应用化学药物可增加γ基因表达或减少α基因表达，以改善β地中海贫血的症状。7α、β－地中海贫血是如何产生的？α－地中海贫血是由于α珠蛋白基因缺失或点突变导致α-珠蛋白肽链失衡而产生的单基因遗传血液病。研究发现，中国地区常见的3种α-地中海贫血主要由--SEA、-α3.7、-α4.2缺失引起。β-地中海贫血是由于β-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病。它们是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病，人群发生率高达10%以上。由于遗传缺陷不同，本病表现轻重程度也不同，有在胎儿及婴幼儿即因极重的溶血性贫血致死的，也有虽有血红蛋白异常而一生无任何临床症状的。

8α-地贫临床表现与基因型的关系是怎样的？临床表现型主要的可能基因型临床表现静止型-α/αα临床无症状标准型--/αα、-α/-α临床上无症状，但血液学检查可呈现平均红细胞体积和平均红细胞血红蛋白的降低HbH病--/-α慢性溶血性贫血，多数伴有肝脾肿大及轻度黄疸，少数严重患者骨骼变化及特殊贫血面容。HbBart’s胎儿水肿综合症--/--胎儿全身水肿，肝脾肿大，四肢短小，腹部因有腹水而隆起。多于妊娠30～40星期时死亡或早产，且早产儿于产后半小时内即死亡。9β-地贫基因型与临床表现是怎样的？临床表现型主要的可能基因型临床表现轻型β-地贫β0/β、β+/β临床无症状中间型β-地贫β+/β+脾脏常肿大，血红蛋白和红细胞数可维持在一定水平，一般不必输血，偶尔就医。重型β-地贫β0/β0、β+/β0、β+/β+生长发育不良，反应迟钝，肝脾肿大，腹部隆起，有特殊的“地中海贫血面容”。10夫妇一方为α-地中海贫血，另一方为β-地中海贫血，是否需要做产前诊断？调查发现，存在不少α-地中海贫血合并β-地中海贫血的患者，这类患者的临床表现和实验室检查所见与单纯性β-地中海贫血患者相似，贫血症状常较轻，易被误诊为单纯性β-地中海贫血。因此夫妇一方为α-地中海贫血，另一方为β-地中海贫血时，若β-地中海贫血一方合并α-地中海贫血，仍有1/4几率生育重型α-地中海贫血患者，此时需做产前诊断。11地中海贫血的遗传方式是怎样的？地中海贫血的遗传与性别无关，男女发病机率均等。静止型和标准型α-地贫在临床上虽无明显症状，但当分别携带α-地贫静止型与标准型