PCR引物设计及相关软件使用

PCR引物设计及相关软件使用重庆大学生物工程学院杨应斌主要内容背景PCR引物设计原那么常用PCR引物设计软件PrimerPremier5.0介绍Oligo6.22介绍在线Primer3介绍PCR聚合酶链反响(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期开展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不适宜的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带〔如形成引物二聚体带〕，不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计的原那么引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间防止形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反响(即错配)。影响因素如引物长度〔primerlength〕，产物长度〔productlength〕序列Tm值(meltingtemperature)引物与模板形成双链的稳定性(internalstability,用∆G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构〔duplexformationandhairpin〕的能值在错配位点〔falseprimingsite〕的引发效率引物及产物的GC含量〔composition〕，等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。一般原那么引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反响。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否那么容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。

一般原那么3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当防止在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反响失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。一般原那么4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反响。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最正确。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。一般原那么6.∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应中选用3’端∆G值较低〔绝对值不超过9〕，而5’端和中间∆G值相对较高的引物。引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反响。一般原那么7.引物二聚体及发夹结构的能值过高〔超过4.5kcal/mol〕易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反响不能正常进行。

一般原那么8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

常用的引物设计软件Oligo6〔引物评价〕*PremierPrimer〔自动搜索〕*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3〔在线效劳〕*PrimerPremier5.0的使用技巧简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析简并引物设计根据氨基酸序列来设计引物DNA引物PremierPrimer5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核〔CiliateMacronuclear〕2、无脊椎动物线粒体〔InvertebrateMitochondrion〕3、支原体〔Mycoplasma〕4、植物线粒体〔PlantMitochondrion〕5、原生动物线粒体〔ProtozoanMitochondrion〕6、一般标准〔Standard〕7、脊椎动物线粒体〔VertebrateMitochondrion〕8、酵母线粒体〔YeastMitochondrion〕PrimerPremier5.0使用介绍(1)PreimerPremier启动界面Loadsequence根本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为总分值每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But…引物编辑引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindowSomeotherusefulfunctionofPP5EnzymeMeltingtemperaturegraphPer25-merGC%graphPer25-merStabilityPer5-mer心肌特异性表达双顺反子载体的构建PMYL2EcoRIpIRESneo－2质粒克隆扩增MYL2序列查询及启动子功能分析不加酶切位点引物设计基因组DNA制备高保真PCRCloning大量纯化的MYL2promoter片段酶切获得无promoter线性质粒载体片段DNALigationReaction

转入DH5aColonyScreeningPCRIdentification

MYL2promoterpIRESneopEGFP-c3质粒克隆扩增酶切获取MYL2promoterPlasmidvector开环分子酶切获得EGFP片段酶切及凝胶电泳鉴定及回收环状DNA分子DNALigationReaction

环状DNA分子转入DH5aColonyScreeningPCRIdentification

rat原代胚胎心肌细胞培养及冻存MYL2promoterpIRES/neo/EGFP心肌细胞脂质体荧光鉴定rat心肌细胞特异表达EGFP无绿色荧光蛋白表