单甲氧基聚乙二醇丙醛分子量20kDa（M-ALD-20K）质量要求与测试方法

1T/CMEASXXXX-XXXX单甲氧基聚乙二醇丙醛,分子量20KDa(M-ALD-20K)质量要求与测试本文件规定了单甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量20KDa（M-ALD-20K）原料的术语和定义、质量要求、试验方法。本文件适用于单甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量20KDa（M-ALD-20K）的质量控制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2020版，四部3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1羟基聚乙二醇二乙基丙缩醛（PDA-PEG20K-OH）化学结构式如下：n=407498单甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量20KDa（M-ALD-20K）由PDA-PEG20K-OH通过端基修饰得到的产物。化学结构如下：n=407~4982号浊度标准液《中华人民共和国药典》2020版，四部通则0902溶液澄清度检查法项下规定的2号浊度标准溶液。4质量要求4.1性状单甲氧基聚乙二醇丙醛应为白色至类白色粉末。不含可见异物。4.2结构确认核磁氢谱测试结果与附录A谱图对照，主要吸收峰的位置应相对应。4.3分子量分子量应为20,000±2,000Da。4.4酸度2T/CMEASXXXX-XXXXpH值应为4.0~7.0。4.5澄清度与2号浊度标准液比较，不得更浓。4.6取代率取代率不得少于95.0%。4.7BHT含量不得过300ppm。4.8目标分子量含量、二醇含量目标分子量含量不得少于95.0%，二醇含量不得过3.0%。4.9多分散度多分散度不得过1.05。4.10残留溶剂异丙醇不得过5000ppm，二氯甲烷不得过600ppm，乙酸乙酯不得过5000ppm，甲基叔丁基醚不得过5000ppm，甲苯不得过890ppm。4.11水分水分不得过1.0%。4.12细菌内毒素内毒素不得过0.1EU/mg。5试验方法5.1性状目测判断样品外观。取1-2g样品置于白纸上，摊开铺平，置于白色背景下肉眼观察观察是否有可见异物。测试结果应符合4.1的要求。5.2结构确证按照《中华人民共和国药典》四部2020年版0441“核磁共振波谱法”测定，样品配制使用氘代DMSO配制成20mg/0.5mL浓度进行测试，300M扫描。5.3分子量按分子量的测定按照《中华人民共和国药典》四部2020年版0431“质谱法”测定，采用MALDI-TOF法测试，300M扫描。按照附录A规定的条件进行测试，测试结果应符合4.2的要求。5.4酸度按照《中华人民共和国药典》四部2020年版0631“pH值测定法”测定，测试结果应符合4.4的要求。5.5澄清度溶液澄清度的测定按照《中华人民共和国药典》四部2020年版0902“澄清度检查法”第一法（目视法）检测，测试结果应符合4.5的要求。5.6取代率3T/CMEASXXXX-XXXX按照《中华人民共和国药典》四部2020年版0512“高效液相色谱法”规定，采用电喷雾检测器（CAD按照附录B规定的条件测试，测试结果应符合4.6的要求。5.7BHT含量采用《中华人民共和国药典》四部2020年版0512“高效液相色谱法”测定，采用UV检测器，按照附录C的方法进行测试，测试结果应符合4.7的要求。5.8目标分子量含量、二醇含量按照《中华人民共和国药典》四部2020年版0514“分子排阻色谱法”规定，按照附录E规定的条件测试，用面积归一化法计算结果，测试结果应符合4.8的要求。5.9多分散度（PDI）按照《中华人民共和国药典》四部2020年版0514“分子排阻色谱法”规定，按照附录D规定的条件测试，测试结果应符合4.9的要求。5.10残留溶剂按照《中华人民共和国药典》四部2020年版0861“残留溶剂法”中第二法测定，按照附录E规定的条件测试，测试结果应符合4.10的要求。5.11水分按照《中华人民共和国药典》四部2020年版0832“水分测定法”第一法测定，测试结果应符合4.11的要求。5.12细菌内毒素采用《中华人民共和国药典》四部2020年版1143“细菌内毒素检查法”中第二法的浊度法，按照附录F的方法进行测试，测试结果应符合4.12的要求。4T/CMEASXXXX-XXXX（规范性）分子量的测定A.1原理MALDI-TOF的原理是将样品分析物分散在小分子基质中并形成共结晶晶体。当用脉冲激光照射晶体时，基质强烈吸收激光能量并转化为晶格的激发能，脉冲激光使样品表面升温至或接近基质发生相变或升华，基质中的样品因振动激发而发生解析附，基质-样品之间发生电荷转移，电离的样品飞过飞行管，根据飞行时间不同而被检测，离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，进而测定样品的分子量。A.2设备与试剂仪器：MALDI-TOF/TOF串联质谱仪、分析天平、移液枪；试剂：乙腈（HPLC级）、水（HPLC级）、三氟乙酸（HPLC级）、乙醇（HPLC级）、BovineSerumAlbumin(BSA，≥98%)、Apomyoglobin,ProteinSequebcingGrade（APSG）、IFBP（牛胰岛素）、CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamicacid）、P14RA.3实验步骤a）BSA储备液的配制：取BSA溶于稀释剂（乙腈：水：TFA=50：50：0.1）溶液中，制成500fmol/μL的溶液；b）APSG储备液的配制：取APSG溶于稀释剂（乙腈：水：TFA=50：50：0.1）溶液中，制成1mg/ml的溶液；c）校准品溶液：用APSG和BSA混合物(V:V=1:1)作为校准品。d）样品处理：取样品用稀释剂30mg/mL氯化钠水溶液制成20mg/ml的溶液，取0.5uL样品和0.5uL基质溶液于靶位上混合，晾干；e）激光多点轰击，信号累加。A.4结果计算根据软件处理谱图得出数均分子量Mn。5T/CMEASXXXX-XXXX（规范性）取代率的测定B.1原理采用高效液相色谱法测定，电喷雾检测器（CAD）检测，采用自身对照法计算单个杂质的含量，样品取代率%=100%-单个杂质含量总和。B.2仪器与试剂仪器：液相色谱仪（配备电喷雾检测器）、分析天平、C18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm试剂：甲醇（HPLC级）、水、M-PDA-20K工作标准品B.3溶液的配制a)样品溶液的配制：取供试品约20mg，精密称定，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，b)对照溶液的配制：精密量取样品溶液1mL，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。c)M-PDA-20K贮备液的配制：取M-ALD-20K工作对照品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。d)系统适用性的配制：取供试品约20mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入M-PDA-20K贮备液0.1ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。B.4操作条件柱温40℃,流速1.0mL/min，进样量10μL，流动相A为水，B为甲醇。CAD检测器，检测器温度35℃,Filter10.0sec,Range500pA。B.5步骤按照B.4操作条件逐一进空白、系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液。B.6结果计算a)根据自身对照法测定单个杂质含量;b)样品取代率为：样品取代率%=100%-所有单杂之和6T/CMEASXXXX-XXXX（规范性）BHT含量的测定C.1原理采用高效液相色谱法测定，紫外（UV）检测，采用内标法计算BHT的含量。C.2仪器和试剂仪器：HPLC-UV、分析天平、C18色谱柱(4.6×250mm,5µm)。试剂：乙腈（HPLC）、水（超纯水）、三氟乙酸（HPLC）、萘（分析纯）、BHT（分析纯）。C.3溶液的制备a)萘内标溶液取20.0mg萘，用乙腈配制成2mg/mL的溶液。b)BHT标样溶液取20.0mgBHT，用乙腈配制成2mg/mL的溶液c)对照溶液取0.1mL萘内标溶液，0.1mLBHT标样溶液，置同一10mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。d)样品溶液样品500.0mg，置10mL容量瓶中，精密加萘内标溶液100uL，用乙腈稀释至刻度，摇匀。C.4操作条件柱温40℃,流速1.0mL/min，进样量20μL，紫外检测器，检测器波长280nm，分析时间10分钟。C.5步骤a)按照B.4操作条件逐一进空白、对照溶液；b)按照B.4操作条件进样品溶液；C.6结果计算C.6.1校正系数;Y=[C(BHT)/C(萘)]/[Area(BHT)/Area(萘)]其中：C(BHT)：对照溶液中BHT浓度（mg/mL）C(萘)：对照溶液中萘浓度（mg/mL）Area(BHT)：对照溶液中BHT峰面积Area(萘)：对照溶液中萘峰面积C.6.2样品中BHT含量为：C(BHT)=YC(萘)[Area(BHT)/Area(萘)]其中：C(BHT)：样品溶液中BHT浓度（mg/mL）7T/CMEASXXXX-XXXXC(萘)：样品溶液中萘浓度（mg/mL）Area(BHT)：样品溶液中BHT峰面积Area(萘)：样品溶液萘峰面积8T/CMEASXXXX-XXXX（规范性）目标分子量含量、二醇含量和多分散度的测定D.1原理GPC原理为基于凝胶柱的分子筛效应。凝胶柱是由交联聚合物制成，具有一定的孔径大小和分布范围。分子在柱中的分离是基于其分子量大小和形状的不同，体积大的高分子无法进入凝胶孔，最先从凝胶颗粒间流出，淋出体积（时间）最小；体积小的进入凝胶颗粒，淋出体积（时间）最大，高聚物按分子量从大到小的顺序出峰。通过做出已知分子量的高分子化合物出峰时间与分子量之间的标准曲线，就能分析未知待测物的分子量。D.2设备与试剂设备：分析天平、示差检测器、HPLC泵、柱温箱、凝胶色谱柱7.8×300mm试剂：甲醇（HPLC级）、一水合溴化锂、聚乙二醇标准品（分子量范围为2000Da~40000Da的5-6个标准品）D.3E溶液配制标准曲线溶液：取聚乙二醇标准品配制成2.0mg/mL的甲醇溶液。样品溶液：将样品配制成2.0mg/mL的甲醇溶液。D.4操作条件柱温30℃,流动相为10mMLiBr甲醇溶液，等度洗脱，流速0.5mL/min，进样量20μL，示差检测器温度30℃,运行时间30min。D.5步骤a）按照C.4操作条件逐一进空白、标准曲线，并制备校准曲线。b）按照C.4操作条件进样样品溶液。D.6结果计算a）按照《中华人民共和国药典》四部2020年版0514“分子排阻色谱法”中大分子聚合物分子量和分子量分布测定法中的规定使用GPC处理软件处理得到多分散度。b）按照《中华人民共和国药典》四部2020年版0514“分子排阻色谱法”中高分子杂质测定法的面积归一化法计算目标分子量含量及二醇含量。9T/CMEASXXXX-XXXX（规范性）残留溶剂的测定E.1原理采用顶空气相色谱法，FID检测器，外标法计算异丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、甲苯的含量。E.2仪器和试剂仪器：气相色谱仪（配备FID检测器、顶空进样器）、分析天平、色谱柱：6%氧丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱为色谱柱；试剂：异丙醇（分析纯）、二氯甲烷（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯）、甲基叔丁基醚（分析纯）、甲苯（分析纯）和二甲基亚砜（DMSO，GC）。E.3溶液的制备E.3.1标准品溶液的配制a)二氯甲烷储备液：取二氯甲烷适量，加DMSO制成每1mL约含6mg的溶液。b)异丙醇储备液：取异丙醇适量，加DMSO制成每1mL约含50mg的溶液。c)乙酸乙酯储备液：取乙酸乙酯适量，加DMSO制成每1mL约含50mg的溶液。d)甲基叔丁基醚储备液：取甲基叔丁基醚适量，加DMSO制成每1mL约含50mg的溶液。甲苯储备液：取甲苯适量，加DMF制成每1mL约含8.9mg的溶液。e)混合对照品储备液：精密量取二氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、甲苯贮备液各1mL置于同一100mL量瓶中，加DMSO稀释至刻度，摇匀，即得。f)对照品溶液：精密量取混合对照品贮备液10mL置于同一100mL量瓶中，加DMSO稀释至刻度，摇E.3.2样品溶液取样品约100mg，精密称定，置于10mL量瓶中，加DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀。取5ml置于20ml顶空瓶中，加盖密封。E.4操作条件顶空进样器设置：加热温度85℃,平衡20min，定量环温度95℃,传输管线温度105℃,分流比5:1；检测器温度260℃。程序升温程序如下：/E.5步骤a)取空白（DMSO）、对照品溶液各取5mL置顶空瓶中，分别进样；T/CMEASXXXX-XXXXb)按照E.4操作条件进样品溶液；E.6结果计算残留溶剂含量C（ppm）=XX1000000其中：C：样品中各组分的含量ppm；Ai：样品溶液中各组分的峰面积；As：对照品溶液中各组分的峰面积；Conc(s)：对照品溶液中各组分的浓度ug/mL;Conc(i)：样品溶液的浓度ug/mLT/CMEASXXXX-XXXX（规范性）细菌内毒素的测定F.1原理在适宜的条件下（温度pH值及无干扰物质）细菌内毒素激活鲎试剂中C因子，被激活的凝固酶切断凝固原蛋白中的精氨酸肽链，形成凝固蛋白，在产生凝胶过程中发生浊度变化，用细菌内毒素测定仪检测反应混合物的吸光度（OD值）的变化。OD值增加的速度与内毒素浓度成正相关。据此，可以定量供试品的内毒素浓度。F.2仪器和试剂仪器：细菌内毒素测定仪、分析天平、旋涡混合仪、移液枪、内毒素测定小管。试剂：内毒素工作标准品、鲎试剂、鲎试剂缓冲液、细