GB31650-2019进一步降低了鸡蛋中磺胺类药物的残留限量,​对养殖企业的质量控制要求更高4种检测方法需掌握

摘要磺胺类药物对大多数的革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌具有很好的抑制作用，在畜禽动物细菌感染性疾病的治疗和预防上使用越来越广泛。而磺胺类药物不规范使用造成其在鸡蛋中残留积聚，被人类食用后，会对人体产生毒副作用。因此，对鸡蛋中磺胺类药物残留进行检测是保证食用安全的关键措施，对维护人民群众舌尖上的安全具有重要意义。文章综述了鸡蛋样品的常见前处理方法以及残留分析检测技术中胶体金免疫分析法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法和超高效液相色谱串联质谱法，并对鸡蛋中磺胺类药物残留检测方法发展前景进行了展望。一背景鸡蛋作为大众补充蛋白质必不可少的动物性食品，因其价格低廉、味道鲜美、营养价值高等优点，一直都是百姓餐桌的必备品。近年来，蛋鸡养殖业迅速发展，在规模化养殖中为了提高蛋鸡生产性能和强化细菌性疾病防治，常常应用抗菌药，而磺胺类药物因其对多种细菌性疾病具有抗菌力强、价格适宜、使用简单、吸收快等特点，常用于畜禽养殖中。而不规范使用此类药物，很容易造成畜禽产品中药物残留，影响环境以及人类身体健康。因此世界许多国家明确规定在食品动物饲养中磺胺类药物作为限制性药物要规范使用。我国《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定了禁止在家禽产蛋期使用磺胺类以及磺胺二甲嘧啶，原农业部2002年第235号公告规定磺胺类药物总量以及单个磺胺药物的最大残留限量标准为0.10mg/kg，并对畜禽产品中磺胺类药物残留情况予以重点监控。当前，对于动物性食品中磺胺类药物残留检测有多种方法，如酶联免疫法、分光光度法、气相色谱法和液相色谱法、超高效液相色谱法等，创建适用鸡蛋中药物残留检测方法研究成果相对较少，为了有效监控鸡蛋中磺胺类药物的残留情况，创建快捷、灵敏度高的检测方法十分重要。为此，本文对国内外研究报道的鸡蛋中磺胺类药物残留检测方法进行了综述，为该药物残留检测提供方法参考，保障人类进食鸡蛋类食品的安全。二磺胺类药物概述磺胺类药物（sulfonamides，SAs）是一种已经应用于临床多年的含有对氨基苯磺酰胺结构的广谱抗菌型化学合成药物，常常和抗生素一起作为添加剂用于饲料中，在兽医临床上由于该药具有良好的细菌性疾病防治效果、使用方便、价格低廉等特点而备受兽医青睐。在享受磺胺类药物优点的同时，它的弊端也伴随出现，磺胺类药物性质稳定而不易分解，应用于动物后直接以原型的形式排出体外，在土壤、微生物或植物中蓄积或贮存，并可长期存在于环境中造成污染。另外，磺胺类药物在动物体内的残留时间为7～14d，不合理的使用容易使该药物在动物体内残留蓄积，并会转移到肉、蛋、奶等动物性食品中。人类食用了这类动物性食品后，可能会出现过敏反应、胃肠道反应，甚至对肾脏会产生极大的损害。

三鸡蛋中磺胺类药物样品前处理方法在残留检测分析中，鸡蛋样品成分复杂，较高的蛋白质和脂肪含量会对目标物质的检测以及仪器设备使用寿命造成影响，另外样品中残留的药物一般处于痕量水平，所以对样品进行前处理提取其中的药物并净化和浓缩，最大限度地将目标物质与干扰物质分离开，消除基质的影响，是整个药残检测过程中最关键的环节。3.1提取磺胺类药物在结构上含有伯氨基和磺酸胺基，呈酸碱两性，极性强，易溶于有机溶剂，常用的提取溶剂有乙腈、乙酸乙酯、甲酸乙腈等。张丽等在用超高效液相色谱串联质谱法检测鸡蛋中20种磺胺类药物时，采用乙腈为提取剂，同时比较了乙酸乙酯、磷酸盐缓冲液等的提取效果，结果发现采用乙腈和乙酸乙酯时回收率均大于85%。胡婷婷等建立了液相色谱串联质谱测定鸡蛋粉中的16种磺胺类药物的方法，采用甲酸-乙腈作为提取剂，发现乙腈中加入甲酸可以沉淀蛋白，有效提取目标化合物，最终平均回收率为79.9%～95.8%。3.2净化当前，固相萃取法、液液萃取法、磁性固相萃取、基质固相萃取、免疫亲和色谱、QuEChERS法等是常见用于检测动物性食品中磺胺类药物残留的主要前处理技术，而用于处理鸡蛋样品最常用的方法是固相萃取法。1）固相萃取法根据液-固相色谱机理，选用匹配样品性质的固相萃取小柱，通过小柱内吸附剂吸附目标化合物并分离杂质和样本基体，再利用适当的洗脱液迅速完成洗脱，实现快速分离和富集。常见的固相萃取柱有HLB柱、MCX柱、PCX阳离子交换柱、C18柱等。马丽娜等建立了高效液相色谱法测定鸡蛋中5种磺胺类药物残留的方法，乙腈2次重复提取样品，再经活化后的MCX固相萃取柱净化，该方法检出限为7.5～20.0μg/kg，回收率达到75.9%～96.5%。鸡蛋样品含有较多油脂以及其他杂质，SPE前处理方法较为复杂。2）QuEChERS采用QuEChERS法对鸡蛋样品进行上机前处理，对鸡蛋中16种磺胺类药物残留检测，并对前处理方法进行了优化，优化后采用1%乙酸乙-腈提取液提取、无水乙酸钠和无水硫酸镁进行盐析和去除水分，净化剂净化，最低定量限在2.0μg/kg以下，3个加标浓度的回收试验回收率为67.0%～115.9%，相比于固相萃取法，该方法具有快捷简便、效率高、适用性广，对于结构、性质差异很大的物质能够同时提取的优点。在QuEChERS法的基础上，刘红等采用了一种能够使样品在前处理中实现不损失分析物的前提下彻底地去脂，并完成分析物的完全回收的方法——QuEChERSEMR-Lipid快速样品提取技术净化，同时与PRIME-HLB固相萃取柱和QuECh-ERS法的净化效果进行了比较，结果显示PRIMEHLB固相萃取柱只能提取14种磺胺类药物中的部分药物，而QuEChERSEMR-Lipid相比QuEChERS法的去脂效果更强，检测结果显示在8～32μg/kg加标回收试验中，回收率为50.09%～102.11%，检出限为0.00131～0.09717μg/kg，QuEChERSEMRLipid检测精密度更高，可满足鸡蛋样品中磺胺类药物快速准确的检测要求。四鸡蛋中磺胺类药物残留检测方法4.1免疫学方法随着各类新兴技术和学科的发展，免疫技术也得到不断更新和完善，其中通过免疫学方法检测动物性食品中药物残留技术已被广泛应用。目前用于鸡蛋中磺胺类药物残留检测免疫学方法主要有2种，分别是胶体金免疫分析法和酶联免疫吸附法，这2种方法检测灵敏度高、准确性好，操作方法简单、迅速、价格低廉，可用于大批量样品检测。1）胶体金免疫分析法20世纪70年代，国外2位科学家将胶体金引入免疫学，之后一种新的免疫学方法——胶体金免疫技术在生物医学各领域被广泛应用。随着科技进步，在医学领域广泛被应用的胶体金技术逐渐引入食品安全检测方向，并发挥着非常重要的作用。以胶体金技术为基础，多种稳定性良好的磺胺类试纸条作为快检手段研发生产。Shim等建立了一种基于单抗与胶体金偶联的快速免疫层析试纸条，用于快速检测鸡蛋中的磺胺二甲嘧啶，该方法能够在10min内完成分析测定，检出限为2ng/mL，样品的回收率结果与间接竞争酶联免疫吸附试验结果一致，成功检测出了鸡蛋中磺胺二甲嘧啶。Wang等建立了快速检测鸡蛋中磺胺嘧啶的免疫层析法。根据竞争反应机理，将磺胺嘧啶-牛血清白蛋白结合物固定在硝酸纤维素膜上特定的检测区，以硝酸纤维素膜为捕捉剂，将磺胺嘧啶的单抗偶联到胶体金颗粒上作为检测试剂，制备检测磺胺嘧啶的免疫层析试纸，15min内完成磺胺嘧啶的半定量检测，回收率为44.8%～60.9%，该检测方法操作步骤简单、安全、交叉反应低，能够作为鸡蛋中磺胺类药物残留的快速筛选方法。2）酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法是将酶作为标记物，通过酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反应后，酶催化底物发生化学反应，形成有色物质来检测。在药物残留检测中多采用竞争ELISA法，即酶标板预包被的偶联抗原与样品中的抗原特异性地竞争抗体，再加入酶标二抗，最后根据显色计算药物含量。谢继安等利用酶联免疫法对包括鸡蛋在内的多种动物源性食品中的7种磺胺类药物残留进行检测，来验证磺胺“七合一”ELISA检测试剂盒的检测效果，该试剂盒对鸡蛋中残留物的检测限为0.52μg/kg，对其他几种动物源性食品的检测限均在0.5μg/kg左右，符合鸡蛋中磺胺类药物残留限量的国家标准(100μg/kg)，对比高效液相色谱法检测，二者检测结果一致，ELISA试剂盒检测时间更快，样品前处理更简单，能够实现大批量样品的快速检测。建立了直接竞争酶联免疫吸附试验来检测鸡蛋中7种磺胺类药物残留，检出限均小于100μg/kg，回收率为77.3%～123.7%，可以满足鸡蛋的检测需求。也通过直接竞争酶联免疫吸附试验检测鸡蛋及其他动物性食品中磺胺二甲嘧啶的残留，在鸡蛋中的检出限为2μg/kg，回收率在74%～117.5%，为了验证酶联免疫吸附试验的有效性，对鸡蛋样品提取物进行了酶联免疫吸附试验和高效液相色谱分析比对，测定结果具有良好的相关性，相关系数大于0.9。酶联免疫法操作方法简便、特异性强、检测所需时间短，适用于大批量鸡蛋样品中兽药残留的检测。4.2色谱及联用法1）高效液相色谱法高效液相色谱法是一种新型的色谱技术，主要由储液器、泵、进样器、固定相、检测器等组成。通过泵的高压作用带动储液器中的液体流动相和检测样品进入色谱系统，样品在色谱柱内反复分配，各成分分离，最后进入检测器检测待测物含量，因为其具有较高的分离速度、分离效率和检测灵敏度而被广泛应用。二极管阵列检测器（DAD）、紫外吸收检测器（UVD）、荧光检测器（FLD）都可用来检测鸡蛋中磺胺类药物残留。马丽娜等建立了高效液相色谱-紫外检测器检测鸡蛋中5种磺胺类药物的残留，检测波长为270nm。5种磺胺类药物线性相关系数良好，检出限7.5～20.0μg/kg，回收率达到75.9%～96.5%。刘明生等建立高效液相色谱-二极管阵列检测器检测鸡蛋中9中磺胺类药物，检测波长为272nm。该方法最低检测限为0.005μg/g，加标回收率均大于83.0%，满足对鸡蛋中多种磺胺类药物残留检测的技术要求。2）液质联用法液质联用法将色谱的分离能力和质谱的定性功能结合到一起，能同时检测多种药物，可对复杂混合物中的各组分进行定性定量分析，效率更高，精密度更好。表1对近年鸡蛋中磺胺类药物残留的检测方法包括仪器方法条件、回收率和灵敏度等进行了汇总。在鸡蛋中磺胺类药物残留检测中色谱条件的优化十分重要，常见的流动相有甲酸水+甲醇、甲酸水+乙腈等。在对此类药物的检测中常使用酸性溶剂来控制流动相的pH，因为磺胺类药物中的对氨基苯磺酰胺结构使其水解产物呈酸碱两性，其解离状态会受流动相pH的变化而改变，从而影响待测物的分离效果。唐韵熙等建立了高效液相色谱串联质谱法测定鸡蛋中8种磺胺类药物，在色谱优化中发现，以乙腈-0.1%甲酸水为流动相可获得最佳的色谱峰形，定量限为0.2μg/kg，平均回收率为66.3%～107.9%。因为磺胺类药物结构含有氨基，呈弱碱性，甲酸可以提供质子使药物形成稳定的[M+H]+，离子化效率提高。表1液质联用技术检测鸡蛋中的磺胺类药物残留量采用超高效液相色谱-质谱联用法测定鸡蛋中7种磺胺类药物残留，流动相为甲醇-0.1%甲酸水，7种磺胺类物质在质量浓度为1～100ng/mL的范围内，回收率在72.9%～105.3%范围内。李文辉等建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡蛋中5种磺胺类药物及其他物质含量的方法，以乙腈-0.1%甲酸水为流动相，方法的检测限为0.5μg/kg，在0.5～100μg/kg的浓度范围内线性关系良好，加标回收率均在66.3%～97.5%，该检测方法准确度高、精密度好适用于鸡蛋中磺胺类药物的残留检测。介绍了一种测定鸡蛋中20种磺胺类药物的残留分析方法，以乙腈-0.1%甲酸水为流动相，在该方法下20种磺胺类药物在0.5µg/kg～50µg/kg的浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.9967；检测限0.2µg/kg，回收率为63.8%～94.6%。该技术将色谱和质谱的优点合并，对基质中的化合物分离能力大大加强，并且可以提供其相对分子质量和结构信息。五结论随着人们生活水平的提高，动物性食品中药物残留问题成为