原生质体的分离培养与细胞培养-原生质体的融合

原生质体培养与体细胞杂交

——原生质体融合方法

主讲人：姜放军湖南生物机电职业技术学院植物组织培养技术定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。原生质体融合体细胞杂交：通过物理或化学的方法使原生质体融合，通过培养获得具有双亲遗传物质的后代。也叫做原生质体融合。问题探究一、原生质体融合意义—克服杂交不亲合—克服生殖器官败育—克服柑桔多胚对照果实处理果实对照种子处理种子

１９６０年英国生物学家科金发明了用酶脱除细胞壁的方法，给植物细胞融合技术扫清了第一道障碍。在许多研究人员成功地进行了不同植物的细胞融合，并培养出了再生植株后，许多人开始尝试培育不同种属的超级杂交植物。１９７８年，德国的梅罗帕斯博士用细胞融合的方法培育出了马铃薯（土豆）和番茄的杂交后代———薯番茄。

先用酶液除去马铃薯、番茄的细胞壁，然后将两种去壁细胞（原生质体）等量混合，在混合液中加进聚乙二醇溶液，使原生质体紧密粘聚，再用高钙和高ｐＨ溶液处理，结果，马铃薯与番茄两种原生质体的融合率竟高达４０％～５０％。他们也曾进行过有性杂交的实验，但都失败了。

01ｅ26超级杂交水稻

通过籼粳亚种间杂交，获得超级优质杂交晚稻01ｅ26，该品种具有产量高、抗性强、米质优等特点.2003年开始在宁海、温岭、温州、福建4个不同纬度的基地试种，其中温岭测产每亩突破750公斤。

01e26超级杂交晚稻番茄+马铃薯

1978年，德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣告，他用马铃薯与番茄相结合，得到了地上部分结青色果实的“薯番茄”，但地下尚未结出马铃薯的块茎。后来，美国堪萨斯州立大学的科学家，把番茄和马铃薯的细胞部分融合在一起，培育出了地上结黄色果实、地下长白色薯块的“番茄薯”，据说番茄的产量很高。二、植物体细胞杂交的主要程序：原生质体的制备原生质体融合杂种细胞的选择杂种细胞的培养杂种植株的鉴定融合过程

产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型三、融合方法1、自发融合自发融合是在酶解细胞壁过程中，由于细胞间连丝的扩展和黏连，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体，每个同核体包含2－40个核。

无机盐诱导融合高pH-高Ca离子聚乙二醇(PEG)法

PEG结合高钙-高pH诱导法电融合技术2、诱发融合

由于质膜表面带负电性，原生质体间互相排斥，所以要采用一定的诱导方法，能促进原生质体的融合。不同来源的原生质体融合形成的杂种原生质体叫做异核体。(一)无机盐诱导融合:NaNO3法

1972年：Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。1973年：Keller用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃时，诱发烟草叶肉原生质体融合。优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用。（二）高pH-高Ca离子法（聚乙二醇）（三）PEG法PEG法原理PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。PEG：略带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥的作用，可使原生质体凝聚。PEG法示意图-+-桥梁+-PEG被洗掉+-+-电荷重排+-+-+-+-膜接触PEG法特点：融合频率高可重复性强诱发融合无特异性毒性较低植物+植物植物+动物动物+酵母PEG处理特点：有异核体形成频率高、重复性高、对细胞的毒性低、融合诱导无特异性。最为常用。具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞（四）PEG结合高钙-高pH诱导法Ca2＋：可以在蛋白质（或磷脂）与PEG的负极性基团间形成桥，因而可促进粘连。(五)电融合技术电融合仪

在现代生物学研究中，细胞电融合是单克隆抗体制备、哺乳动物克隆以及抗肿瘤疫苗制备等最新方法中的一个基本步骤。与通过聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合的化学方法相比，细胞电融合是一种更高效的方法。

Zimmermann教授于1978年创立了细胞电融合的方法。从那以后，他一直致力于进一步发展该技术。Senda1979年首先用此方法实现原生质体融合1.电融合法原理

交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。+-负极正极+-+-+-+-+-+-+-+-

施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-细胞融合仪

细胞先在交流电场中聚集，然后通过直流脉冲融合。特定的缓冲液体系可帮助完成高效的细胞电融合。A．聚集通过双向电泳，细胞互相紧密接触。B．融合脉冲采用仅仅15微秒的方波脉冲穿透细胞膜，细胞膜随后发生融合。C．异核体期细胞膜完全融合，细胞质也完全混合。只有细胞核仍然保持分离状态D．完全融合产物现在细胞核也发生了融合。根据常识，染色体数量下降。ABCD2.电融合的过程燕麦原生质体的融合电融合技术的优点：避免PEG、高pH、高Ca2＋这些非正常生理条件；融合条件数据化，便于控制与相互比较。其他方式融合

神舟四号飞船上进行的太空细胞顺利融合，返回舱里的电融合仪内孕育出首批国产太空生命。应用举例二十世纪80年代末，细胞电融合技术被用于从胚胎细胞克隆哺乳动物。

单克隆抗体制备G.Kohler和C.Milstein将能产生特异性抗体的原代B淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，创立了单克隆抗体制备这种革命性的制备抗体的方法。无数的融合产物经分离和筛选后，将符合要求的单个细胞作为克隆进行扩增，这就是使用“单克隆”一词的原因。这种融合产物被称为杂交瘤.三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定1．互补选择法2、机械分离杂种细胞法3.双荧光标记选择法原生质体发生融合时，有相当一部分并未融合，或发生的是非目的性融合，所以会呈现多种融合状态，故有必要进行筛选出异核体，其主要方法有：1.互补选择法(1)遗传互补选择法

采用缺陷型亲本进行融合产生野生型杂种，从而从整体水平进行有效选择。另外也可以利用原生质体对药物，抗生素的不同抗性来进行筛选。

(2)营养互补选择法也称生理互补法

指亲本双方都有营养缺陷的情况下，只有杂种细胞能在选定的特种培养基上生存，而亲本双方皆不能生存.

如粉蓝烟草和郎氏烟草原生质体融合后，惟有杂种细胞能在无激素培养基上正常生长，而两亲本的细胞则不能分裂，从而可用该方法筛选出杂种后代。

营养缺陷(aB)+营养缺陷(Ab)→自养(AaBb)抗性(aB)+抗性(Ab)→双抗(AaBb)Harms等（1981）2、机械筛选法

该方法不要求原生质体具有特殊的遗传北背景，通过显微镜操作的手段对异核体进行分拣，是最为直接和准确的手段。

虽然此法操作难度较大，但结果正确可靠，是目前常用的筛选方法。异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色3、双荧光标记选择法用荧光染料异硫氰酸荧光素（FITC，绿色）和异硫氰酸罗丹明（RTTC，红光），分别标记两种来源的原生质体。在荧光显微镜下，选择杂种细胞。体细胞杂种植株的鉴定

形态学鉴定细胞学观察

DNA内切图谱分析同工酶分析问题探究1、形态学鉴定2、细胞学观察染色体形态和数目的比较18条染色体36条染色体应用染色体计数法、核型分析和显带技术鉴定观察染色体数目、大小与形态变化。3、DNA内切图谱分析RAPD带型（随机扩增的多态性DNA）杂种细胞线粒体DNA发生重排，出现新的线粒体DNA内谱带。1、细胞杂交产生的新品种或新种应具有A、多种利用价值的新经济植物，B、将一种植物的抗性（抗病、抗寒等）转入另一植物。C、使低光合作用效率的植物转变成高光效植物。D、将豆科植物的共生结瘤固氮能力转入非豆科植物。E、得到高含量次生代谢产物（生物碱等）的植物。细胞杂交的研究进展和存在问题2、体细胞杂交涉及的基本理论问题A、是什么遗传因子和条件决定果实与块茎的形成。