第05章食品中化学物质的一般毒性作用及评价

第五章食品中化学物质的

一般毒性作用及评价学习目的与要求掌握：一般毒性作用的概念、试验的目的；急性毒性的试验设计方法与评价标准；蓄积作用的概念。熟悉：一般毒性试验方法的要点；蓄积毒性试验方法。了解：LD50的计算方法。毒性作用？一般毒性作用：也称基础毒性作用，指外源性化学物在一定的剂量、一定的接触时间和一定的接触方式下对机体（实验动物和人类）产生综合毒效应的能力。可分为急性毒性作用、亚慢性毒性作用和慢性毒性作用。蓄积毒性特殊毒性作用：包括致突变、致癌、致畸，简称为“三致”。第一节急性毒性作用新外源化合物首先需必须阐明其急性毒性的强度及特征。一、基本概念和目的二、急性毒性试验设计三、急性毒性评价四、LD50应用中的有关问题五、急性毒性替代试验一、概念和试验目的1．概念急性毒性（acutetoxicity）是指机体（实验动物或人）一次接触或24小时内多次接触一定剂量外源化学物后在短期（最长到14天）所引起的机体的毒性效应（包括一般行为、外观改变、大体形态变化等），以及死亡效应。实际工作中，机体接触化学毒物的方式或途径不同，急性接触的含义也有所不同。一次接触是指瞬间给实验动物染毒，如经口染毒、经注射途径染毒。经呼吸道与经皮肤染毒而言，则是指在一个特定的期间使实验动物持续地接触化学物的过程。当化学物毒性很低，需要给予动物较大剂量时，可在24小时内分多次给予，这时的急性接触即为“多次”，一般不超过三次。急性接触的时间和次数中毒效应出现的时间急性毒性效应一般是指机体接触化学物后，在较短时间内观察到的毒性症状。有的化学毒物在实验动物接触几分钟内即可产生严重中毒症状，甚至瞬间死亡；而有些化学毒物几天、十几天后动物才产生明显的中毒症状和死亡，呈现迟发毒效应。有的化学毒物在出现快速和剧烈的毒效应后很快恢复；有的化学物早期仅有较轻微症状，几天后又出现严重中毒症状甚至死亡。在实际工作中，大部分毒物的急性毒性症状在短期内出现，一般为7~14天。2．急性毒性试验的目的测定毒物的致死剂量以及其他急性毒性参数，LD50为最主要的参数，并根据LD50值进行急性毒性分级。其他毒性参数还有LD100、LD01、LD0等。通过观察动物中毒表现，毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量-反应（效应）和对人类的潜在危险性程度。为重复剂量、亚慢性和慢性毒性研究及其他毒性试验提供接触剂量的设计依据，并为观察指标的选择提出建议。为毒理学机制研究提供初步线索。

3．有关急性毒性试验常见的参数急性毒性上限参数，以死亡为终点：半数致死剂量或浓度（LD50或LC50）；绝对致死剂量或浓度（LD100或LC100）；最小致死剂量或浓度（MLD，LD01或MLC，LC01）；最大耐受剂量或浓度（MTD，LD0或MTC），或称为最大非致死剂量（MNLD）。急性毒性下限参数，以非致死性急性毒作用为终点：观察到有害作用的最低水平（急性毒性LOAEL）；未观察到有害作用的水平（急性毒性NOAEL）。因此，急性毒性试验可以分为两类。一类是以死亡为终点，以检测受试物急性毒性上限指标为目的的试验，这类试验主要是求得受试物的LD50值。另一类急性毒性试验检测非致死性指标。1.试验动物的选择和要求2.动物喂养环境3.染毒方法4.剂量选择及分组5.试验周期6.毒性观察7.LD50的计算方法二、急性毒性试验设计一般原则：毒性反应与人相近；操作方便，易饲养和管理；品系纯，价格低，易获取；选择两种以上动物分别求其急性毒作用参数。其他条件选择：年龄：刚成年的健康动物；性别：雌、雄各半；雌、雄分笼喂养；分组：随机分组；检疫期：1~2周，如是猫、狗，则须检查肠道寄生虫或直接驱虫治疗。1．实验动物的选择和要求一实验动物喂养室室温应控制在22±3℃，家兔可控制在20±3℃，相对湿度30%-70%，无对流风。每笼动物数（饲养密度）以不干扰动物个体活动及不影响试验观察为度，必要时单笼喂养。饲养室采用人工昼夜为好，早6点至晚6点进行12小时光照，其余时间黑暗。一般食用常规试验饲料，自由饮水。垫料合格，室内卫生。2．实验动物饲养环境3．实验动物的染毒方法经皮肤注射途径喂饲法灌胃

吞咽胶囊

静式吸入动式吸入经口经呼吸道4．剂量选择有分组（1）查阅文献了解化学毒物的结构、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。确定使用哪种方法计算LD50，然后再设计剂量分组。LD50的计算方法常用改良寇氏法、概率单位法、霍思法等。找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。根据确定的剂量组进行染毒。根据预试验的死亡资料确定组距。（2）预试验可根据以下公式计算出剂量分组：i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1)或i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)；n为设计的剂量组数。根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。例如几率单位法、寇氏法一般设6～10个剂量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得i值后．以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。

12345LgLD0LgLD0+iLgLD0+2iLgLD0+3iLgLD0+4i•••（3）正式试验5．试验周期急性毒性试验除计算受试物的LD50/LC50外，还需要通过观察实验动物的中毒症状判断受试物的毒作用性质，推断中毒的靶器官等。因此，试验周期一般为2周。一般要求的观察时间为14天许多化学物在动物接触后很快死亡，如氰化物。也有些化学物所致的中毒症状发展迟缓，可出现迟发性死亡，如有机磷农药中毒-脑病。另外，由于动物个体差异，死亡时间也不同。如小鼠腹腔注射过氧化二碳酸二环己酯（DCPD），同一组动物的最早死亡时间为注射后7h，最迟为150h（6d）。6．毒性观察（1）观察时间注意：任何LD50或相关参数测定，均应标明接触时间。目的：观察外源化学物急性毒性的重要环节，同时可以弥补LD50参数的不足。内容：中毒的发生、发展、规律；体重改变；死亡前症状、特点；死亡时间等。（2）症状观察啮齿类动物化学物中毒主要观察内容

系统和器官中毒后常见表现中枢神经系统和神经肌肉系统体位异常,叫声异常,活动增多,呆卧少动,肌颤,痉挛,抽搐麻痹,后肢无力,运动失调,管状尾,对外界刺激过敏或迟钝植物神经系统瞳孔扩大,流口水,流泪,出汗呼吸系统鼻孔溢液,鼻翼煽动,呼吸深缓,呼吸过速,张口或腹式呼吸泌尿生殖系统会阴部污秽,有分泌物,阴户或乳腺肿胀,阴茎突出,遗精皮肤和被毛皮肤充血,紫绀,被毛蓬松,污秽眼睛眼球突出,充血,角膜浑浊,血性分泌物体重改变可以反映动物染毒后的整体变化。若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可以在体重上反映出来。对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物．应在观察期14天内称量其体重的变化．以便了解受试物引起毒效应的持续时间。（3）体重测量实验动物染毒后的死亡时间也应记录和分析，死亡时间的分析可以提供一些重要信息。久效磷小鼠经口与腹腔注射染毒，均呈现随染毒剂量增加，死亡时间缩短，死亡时间与染毒剂量之间呈直线负相关，提示实验动物致死是可能由于化学物原形所致。DCPD给大鼠腹腔注射染毒，染毒剂量对数值与死亡时间呈明显负相关；但给小鼠腹腔注射染毒，则无明显相关。可能与化学物在大鼠和小鼠体内代谢不同有关。（4）死亡时间对死亡的动物应及时做大体解剖检查和病理组织学检查，观察内脏器官大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，有无充血、出血、水肿、坏死等改变，对有变化的器官应进行病理组织学检查。如果有阳性发现，应以此为线索，进行下一步研究，为之后的亚慢性和慢性毒性试验提供参考观察指标。对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查．必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目，如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。（5）病理检查三、急性毒性评价为评价外来化学物急毒的强弱及对人类的潜在危害程度，国际上提出了化学物急毒的分级标准用以对急毒进行评价。为便于比较化学物的毒性及有毒化学物的管理，国内外根据LD50的大小提出了许多分级标准。但分级标准尚不统一。不管是国际、国内制定的标准都存在不少的缺点和不足，尚有待改进。

注意：急毒不大，慢毒可能很大。因此不能将急毒分级与慢毒分级混淆。毒性分级

外源化学物急性毒性分级(WHO)

毒性分级大鼠一次经口LD50(mg/kg)六只大鼠吸入4小时死亡2~4只的浓度(ppm)兔经皮LD50(mg/kg)对人可能致死的估计量g/kg总量(g/60kg)剧毒<1<10<5<0.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250微毒5000~10000~2180~>15>1000化学物经口急性毒性分级标准（我国，1994）

急性毒性分级大鼠经口LD50(mg/kg)大约相当70kg人的致死剂量6级,极毒<1稍尝,<7滴5级,剧毒1~507滴~~1茶匙4级,中等毒51~5001茶匙~35克3级,低毒501~500035~350克2级,实际无毒5001~15000350~1050克1级,无毒>15000>1050克四、LD50应用中的有关问题1927年Trevan引入了半数致死量LD50（LC50）的概念来评价急性毒性，此后该指标得到广泛应用，并成为急性毒性的主要指标。在药物研究中，评价药物急毒的大小，比较不同药物毒性的大小；计算药物的治疗指数；为后续的重复给药毒理学试验提供剂量参考；比较不同途径的LD50值，获得生物利用度的信息；试验中毒量及其体征为临床不良反应监测提供参考。1．LD50具有重要的毒理学意义LD50（LC50）是一个统计量，它受到许多因素的影响，包括实验动物的物种、品系、性别、年龄、受试化学物的浓度、稀释溶液的性质、喂养条件以及操作者的熟练程度等。因此，在比较不同实验室的LD50时要考虑到各种影响因素的存在，以及实验条件的等同性。另外，即使各个条件都相同，由于实验动物的抽样误差，LD50的差别依然存在。2．LD50的波动性同一化学物不同实验室LD50测定结果的差异

染毒途径毒物总数平均差异倍数最大差异倍数经口20513吸入203.811皮下301.874.8经皮未说明1.744腹腔251.251.8化合物范围（mg/kg）比值（max/min）五氯酚74~6208.38水杨酸钠930~23282.50苯胺479~11692.44乙酰苯胺723~30604.23氯化镉105~4824.59曾经有研究组织13个国家的11个实验室，统一主要的实验条件对5种化学物的LD50进行测定。根据收集到的80个实验结果分析，结果仍存在相当大的差别，可达2.44~8.38倍。LD50（LC50）虽然是一个重要的急性毒性参数，但它只能表示一种外源化学物引起实验动物死亡一半的剂量(或浓度)，不能反映急性毒性作用的特征，也不能反映其毒作用带的宽或窄。为弥补LD50（LC50）的不足，实验中还要详细描述实验动物的中毒特征，并选择其它的参数，如急性毒作用带。3．LD50的局限性消耗的动物量大；获得的信息有限；测得的LD50仅仅是一个近似值；在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。五、经典急性毒性试验的局限性急性毒性替代试验（P141）第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价一、基本概念及试验目的二、亚慢性毒性试验设计三、慢性毒性试验设计四、亚慢性、慢性毒性作用评价一、基本概念及试验目的1．亚慢性、慢性毒性作用的概念慢性毒性作用：指人或实验动物长期（终生）反复接触外源化学物所产生的毒性效应。亚慢性毒性作用：指人或实验动物连续较长时间接触较大剂量的外来化学物所出现的中毒效应。2．亚慢性、慢性毒性作用的试验目的（P147）确定受试物亚慢性和慢性毒性的效应谱，对在急性及亚急性毒性试验中发现的毒作用提供新的信息，并发现在急性及亚急性毒性试验中未发现的毒作用；研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官；研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量—反应(效应)关系，确定其观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），提出此受试物的安全限量参考值;研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性；亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提供依据；确定不同动物物种对受试物亚慢性和慢性毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据。二、亚慢性和慢性毒性作用及评价亚慢性毒性试验设计慢性毒性试验设计亚慢性、慢性毒性作用评价1．亚慢性毒性试验设计试验动物的选择试验动物的喂养环境剂量的选择与分组染毒途径试验周期观察指标原则上要求对受试物代谢过程基本与人类相似,应当是急性毒性试验已证明的对受试物敏感的种属和品系,同时还应考虑与慢性毒作用试验中预计使用的动物种属和品系相同。若无法掌握这一情况，则应有两种实验动物，一种为啮齿类，另一为非啮齿类，以便了解受试物毒性特征。也应参考观察指标的需要而选择，如需多次抽血检查则不宜用小鼠。性别选择一般雌雄兼用，特殊试验可选用单性别动物。如对性腺影响试验。年龄选择大鼠4周，重50克；小鼠3周，重10克。（1）试验动物的选择在亚慢性试验期间，动物饲养条件及环境可能影响毒性效应，应注意营养平衡和环境的稳定，必须有营养合理的饲料、充足干净的饮水和清洁的生活环境。并保持适宜的温度和湿度，以保证动物健康。当受试验物在饲料中的比例较高（大于5%）时，须考虑其可食性及营养平衡问题，还要避免经胃肠代谢后的毒物又被动物摄取而影响试验结果。不同物种的动物应分室饲养，笼具要保证实验动物可自由活动，必要时单笼饲养，且应有人工昼夜设施。（2）试验动物的喂养环境所选剂量上限应在试验期不引起动物死亡或个别死亡，但要有明显的中毒效应或靶器官出现明显损伤。可参考急毒试验的阈剂量为其上限，也可用1/20-1/5LD50。亚慢性试验应求量-效关系，因此至少设置3-4个剂量组、1个正常对照组，必要时加1个溶剂对照组。每组动物大鼠20-40只、家兔10-20只、狗6-8只、猴2-4只，若试验中期需处死部分动物作病理解剖检查时应相应增加动物例数。（3）剂量的选择与分组染毒途径先要尽量模拟人类在环境中接触该受试物的途径和方式，其次应与后来预期要进行的慢毒试验的接触途径一致。经口接触一般采用饲喂法。但应注意动物厌食或拒食。经呼吸道吸入接触的时间随所接触受试物而定，如为工业毒物可接触1-4小时，环境污染则可适当延长至4-8小时。每日接触受试物应定时，以减小接触量和反应误差。（4）染毒途径试验周期一般占实验动物寿命的1/10。因为不同动物的寿命不同导致实验周期有所不同，从几个月至1年不等。一般对长周期、经常接触的受试物可选择90天试验周期，而对阶段性接触的受试物可选择30天。（5）试验周期亚慢性试验中观察指标比较广泛，其选择十分重要。常根据急性、蓄积性试验提供的线索及相关资料，选择一些特异和非特异指标，包括一般性指标、血液和行为学检查、生理生化指标、病理解剖学与病理组织学检查及器官系数测定等。一般指标病理学检查特异指标（6）观察指标一般指标为非特异指标，是外来化学物对机体毒性作用的综合性总体反映。主要包括：动物体重：反映化学物对消化系统和代谢的影响。食物利用率：摄食量与体重的增长比率。同样反映化学物对消化系统和代谢的影响。症状：主要有毛色、眼分泌物、呼吸、神态及行为。脏器系数：脏器湿重与体重的比率。可反映具体受损的器官。一般生化指标：主要是血象和肝肾功能指标。病理学检查凡是在染毒过程中死亡的动物，均应即使解剖进行病理组织学检查，必要时作组织化学或电镜检查。检查时所选脏器应参照急性毒性试验的脏器改变或亚慢性毒性试验的中毒症状而定。必要时可进行所有脏器的病理组织学检查。特异指标特异指标是指对机体亚慢性毒性作用本质的特征性指标。其与受试物的中毒机制密切相关。指标选定一是全面分析受试物急性毒作用特征，初步发现主要危害的系统、器官和组织，来发现一些敏感或特异性指标；另一方面是通过文献检索，参考一些化学物的同系物、某些特殊基团具有的特定毒性，利用构效关系的共性来选择特异性指标。慢毒试验是制定人体日允许摄入量所需的关键性资料。2．慢性毒性试验设计因慢毒试验为动物的大部分生命周期甚至终身，因此只能选用生命周期较短(2~3年)的动物。又要对饲养条件、生化系统、繁殖、自发性疾病均有比较系统的了解，故传统上选用大鼠（3-4周，50-70克）、小鼠（3周，10-12克）。并要求品系明确一致（取决于被检物的毒作用部位及毒剂量的总的敏感性，一般选对致癌物敏感的品系），雌雄各半。动物数量要求与亚慢性毒性试验相似。（1）试验动物的选择饲养条件和饲养环境要求与亚慢性毒性试验相同，如应保证试验动物有温湿度适宜的生活环境及合理的营养。注意动物的营养成分可影响慢毒试验的结果，如半合成饲料可增加致癌物的敏感性，黄酮类及大蒜素相反。（2）试验动物的喂养环境试验分零剂量组、预期无作用剂量组、阈剂量组、发生轻微但有明确毒效应剂量组和发生明显的毒效应甚至亚致使死水平剂量组，以求量效关系。必要时加溶剂对照组。剂量选择参考：①亚慢毒试验结果：高剂量组为1/5-1/2阈剂量，轻微毒效应组为1/20-1/10阈剂量，慢毒阈剂量组为1/50-1/20阈剂量，预期无作用剂量组为1/10最大无作用量、1/100阈剂量或10-50倍人群实际最大摄入量。②急毒实验结果：高剂量组为1/10LD50，慢毒阈剂量组为1/100LD50，预期无作用剂量组为1/1000LD50。③美国环保局建议：0.125MTD和0.25MTD。MTD(最大耐受量):试验组动物较对照组动物体重减轻不超过10%、无死亡、无中毒症状和病理损伤的最大量。（3）剂量的选择与分组慢毒试验多采用经胃肠道与呼吸道接触。经胃肠道接触一般将受试物与食物或饮水混合，由动物自然摄入。但若受试物有异味或易水解时可采用每日定时灌胃。经呼吸道接触，依试验要求定每日接触时间，如为工业毒物的试验通常要求每日吸入4-6小时，如为环境污染物一般要求每日吸入8小时或更长时间。（4）染毒途径其依试验的要求和实验动物种类而定。使用大、小鼠时，工业毒理学要求6个月；食品和环境毒理学一般要求1年以上至2年。若与致癌试验结合进行，则最好长达接近动物的预期寿命，甚至终生。有人认为大鼠90天试验即可确定慢性无作用水平；也有主张终生接触才能全面反映受试物的慢毒效应及求出阈剂量或无作用量。（5）试验期限应以亚慢毒试验的观察指标为基础，选择亚慢毒试验中已呈现有意义的变化指标。一般常规观察指标包括肝、肾功能，健康状况、体重、血液及其它生化指标。对死亡动物及试验结束时应作病检。为减小误差和排除陋检，应注意：试验前应对观察指标进行正常值检查，剔除差异大的动物；观察应与对照组同步进行并作对比；检测方法应稳定，并有质量控制；应在不同间隔（于6、12、18个月）处死部分动物检测，以了解是否有进行性和可逆性变化。（6）观察指标三、亚慢性、慢性毒性作用评价了解受试物毒性的大小及靶器官，并找出敏感的毒效应指标，即最早出现在最低剂量组并与对照组比较差异有显著性的毒效应指标。1．基本评价参数敏感毒效应指标出现改变的最小剂量。用最低有害作用水平（lowestobservedadverseeffectlevel，LOAEL）表达。最大无作用量（不引起机体某种毒效应的最大剂量）。用无明显有害水平（NOAEL）表达。LOAEL或NOAEL是评价化学物对机体损害的主要指标，但应注明动物、试验条件及观察指标。以此为基本可制定化学物的接触极限。2．亚慢性毒性作用评价我国《食品安全性毒理学评价程序》规定：最大无作用剂量小于或等于人可能摄入量的100倍，则表示毒性很强，应放弃该化学物的使用；若最大无作用剂量在100-300倍之间，可进行慢毒试验；若大于或等于300倍，则不必进行慢毒试验，可直接进行毒性评价。3．慢性毒性作用评价如慢毒试验中未发现致癌性：最大无作用剂量小于或等于人群的可能摄入量的50倍，表示毒性较强