生物检测PCR技术

PCR检测技术生物技术教研室：郑鸣目录PCR技术简史PCR的原理PCR的反应条件PCR的类型和应用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR只是一个简单的不起眼玩艺。

——凯利·穆利斯（KaryMullis)我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。……它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。

——凯利·穆利斯（KaryMullis)生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段DNA聚合酶引物引物M13噬菌体Sanger的测序技术引物DNA聚合酶引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循环PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理50℃引物1引物2DNA引物PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理72℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理第1轮结束95℃第2轮开始PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌特异性高引物的特异性。引物延伸时，碱基配对的正确性。TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性。靶基因的特异性与保守性。选择扩增特异性和保守性高的靶基因区域，扩增产物的特异性程度就更高。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点简便、快速整个PCR的扩增在一个小小的离心管中完成，过程也只是简单的温度变化，耐高温的TaqDNA聚合酶的应用，避免了DNA聚合酶的反复加入。一次性加好反应液，2～4小时完成扩增对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）引物（primer）引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带，不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。引物设计的基本原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。引物（primer）具体因素引物长度（primerlength）产物长度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用∆G值反映)形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplexformationandhairpin）的能值在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition）……引物（primer）引物的长度：一般为15-30bp，常用的是18-24bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。

例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3x109/412=200).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点。引物（primer）引物设计的一般原则引物（primer）引物设计的一般原则引物的Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过4～6度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.

经验公式：Tm=2(A+T)+4(C+G)（primer5.0）Nearestnei:最近邻位（oligo6.0）引物（primer）引物设计的一般原则引物序列的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加A或T；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加G或C。引物3’端的序列要比5’端重要引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。引物（primer）引物设计的一般原则引物序列在模板内应当没有相似性较高、尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物（primer）引物设计的一般原则可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高。

错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。引物（primer）引物设计的一般原则ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。

一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（能值越高越容易结合）引物（primer）引物设计的一般原则引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。

与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。

引物（primer）引物设计的一般原则Oligo6（引物评价）*PrimerPremier（自动搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在线服务）*引物（primer）引物设计的常用软件PrimerPremier5.0的使用简介主要功能:引物设计限制性内切酶位点分析DNA基元(motif)查找同源性分析简并引物设计根据氨基酸序列来设计引物DNA引物PremierPrimer5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核（CiliateMacronuclear）2、无脊椎动物线粒体（InvertebrateMitochondrion）3、支原体（Mycoplasma）4、植物线粒体（PlantMitochondrion）5、原生动物线粒体（ProtozoanMitochondrion）6、一般标准（Standard）7、脊椎动物线粒体（VertebrateMitochondrion）8、酵母线粒体（YeastMitochondrion）PrimerPremier5.0使用介绍(1)PreimerPremier启动界面Loadsequence基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面Sensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimerFirstyoucandesigntheprimermanually引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏都none，But…引物编辑引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow用primer5.0对引物评价duplexformation:这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，形成二聚体的能值，引物3‘端有无配对碱基(最好没有)。hairpinformation:是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看3’端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值，不超过4.5。falseprimingsite:如果模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分析，看你的引物（尤其3‘端）是否与特定模板的其他位点结合。PCR：总结性的显示引物位置，产物大小，Tm值等参数，你可以横向比较一下，Oligo6.0使用说明主要功能：专门的引物设计和分析软件Oligo6.44启动界面Opensequencefile3个弹出窗口Meltingtemperature∆GInternalStabilityFrq为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。用Oligo

设计引物时的3个标准Tm值曲线以选取5’到3’的下降形状有利于引物引发聚合反应。Frq曲线宜选用3’端Frq值相对较低的片段。ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。选中引物上游引物下游引物只是示意图引物分析首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。引物分析二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。引物分析第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。第四Falsepriming检查引物分析KeyinformationofprimerHairpinDimerandcrossDimerGC%TotalPCRinformationFinalPCRinformationSearchforprimerusingOligo

6.0Searchprimer利用oligo6.0进行引物评价duplexformation:这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，主要是看引物3‘端有无配对碱基(最好没有)。形成的二聚体要看能值，能值越低越好，最好不要超过4.5hairpinformation:是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看3’端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值，不超过4.5。如果引物中加入酶切位点，可能会有发夹结构且能值不会太低，这就需要灵活控制退火温度了。compositionandTm:分析上下游引物的碱基组成，GC比和Tm值，原则我就不多说了。falseprimingsite:如果模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分析，看你的引物（尤其3‘端）是否与特定模板的其他位点结合。一般错配的引发效率以不超过100为好，但并不绝对，如果正确结合位点的引发效率为450以上，而有一个错配的引发效率是120左右的，这个引物也是可以接受地！！PCR：总结性的显示引物位置，产物大小，Tm值等参数，你可以横向比较一下，尤其是给了一个optimalannealingtem还是可以参照一下地。也给了简单的评价供参考。利用oligo6.0进行引物评价每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。引物（primer）引物浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低模板（template）单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。浓度一般为100ng/100L，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。核酸的分离纯化尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。制备细胞及破碎细胞消化蛋白质,去除生物大分子去除不需要的核酸分子沉淀核酸,去除杂质基本步骤：基本原则：模板（template）基因组DNA的提取

CTAB法

SDS法其它核酸的分离纯化模板（template）非基因组DNA的提取质粒DNA的提取

碱裂解法煮沸法

线粒体、叶绿体DNA的提取

差速离心结合SDS裂解法核酸的分离纯化模板（template）

CTAB法原理CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃

时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。基因组DNA的提取方法简介

CTAB法（植物DNA提取经典方法）

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇

终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除

CTAB提取缓冲液的经典配方

CTAB法（植物DNA提取经典方法）

组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇

终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

CTAB提取缓冲液的改进配方

CTAB法（植物DNA提取经典方法）植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液

CTAB法流程图

CTAB法（植物DNA提取经典方法）SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）

NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%SDS法DNA提取缓冲液

SDS法基因组DNA的提取方法简介动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液SDS法流程图（以动物组织为例）

SDS法物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法根据细胞裂解方式的不同有：其它方法基因组DNA的提取方法简介吸附材料结合法：根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料

阴离子交换树脂磁珠

高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。其它方法基因组DNA的提取方法简介浓盐法：

有机溶剂抽提法：

密度梯度离心法：

利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物根据核酸分离纯化方式的不同有：其它方法碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。质粒DNA的提取非基因组DNA的提取方法简介对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液碱裂解法流程图质粒DNA的提取煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。质粒DNA的提取

细胞器DNA－差速离心法差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。非基因组DNA的提取方法简介I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中基因组DNA的提取基本步骤I.材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取质粒DNA的提取菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁II.破碎细胞或包膜采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取质粒DNA的提取III.核酸分离、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理III.核酸分离、纯化多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。III.核酸分离、纯化多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤III.核酸分离、纯化当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解基因组DNA的提取质粒DNA的提取IV.核酸的沉淀、溶解DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

原因对策材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题二：DNA降解。对策

原因DNA提取常见问题实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少。对策

原因DNA提取常见问题异硫氰酸胍/苯酚法

原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。RNA的提取方法简介

步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70％乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。异硫氰酸胍/苯酚法RNA的提取方法简介影响RNA提取的因素

材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，－70℃短期保存异硫氰酸胍/苯酚法

样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量影响RNA提取的因素异硫氰酸胍/苯酚法

纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素异硫氰酸胍/苯酚法

RNA的降解

OD260/OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳RNA的提取常见问题

新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。

RNA的降解

冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。

RNA的降解OD260/OD280

比值偏低

蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。

抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。OD260/OD280

比值偏低电泳带型异常

非变性电泳：上样量超过

3ug，电压超过

6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致

28S和

18S条带分不开。

变性电泳条带变淡：

EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。下游实验效果不佳RNA降解

抽提试剂的残留

75%乙醇洗涤

样品中杂质的残留

多糖等杂质，再次沉淀

DNA污染

使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNAMg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。Mg2+（magnesium）PCR反应条件的选择温度时间循环次数温度与时间的设置设置变性-退火-延伸三个温度点。标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。温度与时间的设置变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性若低于93℃则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。温度与时间的设置退火温度与时间退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想温度与时间的设置退火温度与时间经验公式：Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合延伸温度：一般选择在70～75℃之间常用温度为72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）3～4kb的靶序列需3～4min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。温度与时间的设置延伸温度与时间循环次数的设置决定PCR扩增程度主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多PCR的类型和应用RT-PCR（reversetranscriptionPCR）不对称PCR（AsymmetricPCR）多重PCR（multiplexPCR）反向PCR(reversePCR)LP-PCR（Labelledprimers)原位PCR（InSituPCR,Is－PCR）巢氏PCR（NestedPCR,N-PCR）实时荧光定量PCRRT-PCR（reversetranscriptionPCR）ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增逆转录酶先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。基因蛋白质多肽链RT-PCR（reversetranscriptionPCR）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针;基因组DNA结构功能的研究高浓度引物低浓度引物不对称PCR

多重PCR（multiplexPCR）多重PCR是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段引物用于检测特定基因序列的存在或缺失。是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列反向PCR(reversePCR)已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR

LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记，用以直观地检测目的基因。细菌1细菌2细菌3细菌4可同时检测多种基因成分，适合基因诊断和生物检测。标记引物ＰＣＲ观察PCR产物LP-PCR（Labelledprimers)原位PCR（InSituPCR,Is－PCR）原位分子杂交（insituhybridization）

原位PCR技术是PCR技术和原位杂交技术结合的产物，其基本过程是，先用合适的固定剂对组织或细胞进行固定，然后用蛋白酶对细胞进行通透处理，以确保PCR试剂进入细胞并同靶序列接触，最后于Eppendorf管中或载玻片对DNA和RNA进行细胞内原位扩增。原位PCR（InSituPCR,Is－PCR）A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达巢氏PCR（NestedPCR,N-PCR）实时荧光定量PCR巢式PCR也叫套式引物PCR，由于扩增过程中用了两对具有嵌套形式的引物而得名。

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法定义实时荧光定量PCR原理之实时原理

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。常规

PCR技术实时定量PCR技术实时荧光定量PCR原理之定量原理通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析扩增曲线？荧光阈值？Ct值？原理之定量原理

扩增曲线图：

横坐标：扩增循环数（Cycle）；

纵坐标：荧光强度

每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍

手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99。真正的信号:荧光信号超过域值原理之定量原理C