第十章 DNA生物合成-复制课件

DNA的生物合成（复制）DNABiosynthesis第九章第十章-DNA生物合成-复制本章内容第一节DNA复制的特点第二节DNA复制的酶学第三节DNA生物合成过程第四节逆转录第五节DNA损伤与修复第十章-DNA生物合成-复制

DNA是生物遗传的主要物质基础，生物体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。第十章-DNA生物合成-复制

中心法则1958年,Crick在总结了遗传信息从DNA到蛋白质的流动方向之后，提出了中心法则（centraldogma）第十章-DNA生物合成-复制中心法则代表了大多数生物遗传信息贮存和表达的规律，并奠定了在分子水平上研究生命科学关键问题的理论基础。从DNA到蛋白质，通过转录和翻译，用基因的遗传信息在细胞内合成有功能意义的各种蛋白质，这就是基因表达（geneexpression）。

第十章-DNA生物合成-复制1970年，Temin阐明了反转录现象的机制

第十章-DNA生物合成-复制Reversetranscription第十章-DNA生物合成-复制DNA复制的特点第一节第十章-DNA生物合成-复制一、半保留复制(semiconservativereplication)（一）概念（二）实验依据：密度梯度实验（三）生物学意义：

1.保证遗传信息传递的忠实性

2.遗传和变异的统一第十章-DNA生物合成-复制（一）DNA半保留复制概念

DNA进行复制时，双螺旋结构解开而成两股单链，各自作为模板（template），用于合成新的互补链（complementarystrand）。子代细胞出现新的DNA双链，其中一股单链是从亲代完整地接受过来的，另一股单链完全重新合成，即两个子细胞的DNA双链，都和母细胞DNA碱基序列完全一致。第十章-DNA生物合成-复制AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA

复制过程中形成的复制叉子代DNA

第十章-DNA生物合成-复制1958年由M.Meselson

和F.Stahl所完成的实验所证明。将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开。（二）DNA半保留复制的实验证明第十章-DNA生物合成-复制密度梯度实验

——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代梯度离心结果第十章-DNA生物合成-复制二、双向复制(bidirectionalreplication)

原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。第十章-DNA生物合成-复制A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC第十章-DNA生物合成-复制5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’真核生物复制多个起始点第十章-DNA生物合成-复制复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）第十章-DNA生物合成-复制三、半不连续复制(semi-discontinuousreplication)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。第十章-DNA生物合成-复制3

5

3

5

解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)第十章-DNA生物合成-复制四、需要RNA引物(primer)

DNA聚合酶不能直接聚合游离的dNTP，必须由一段核酸片段提供3’－OH末端。第十章-DNA生物合成-复制DNA复制的酶学第二节第十章-DNA生物合成-复制一、DNA复制的体系

（一）底物：dNTP,N=A,T,C,G

（二）模板：DNA单链（三）引物：RNA，提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合

（四）酶和蛋白质因子：第十章-DNA生物合成-复制(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

第十章-DNA生物合成-复制二、DNA复制的酶学

（一）解螺旋酶（helicase）

可以将DNA双链解开成为单链。大肠杆菌中发现的解螺旋酶为DnaB。第十章-DNA生物合成-复制（二）DNA拓扑异构酶DNA

（topoisomerase）

通过切断并连接DNA双链中的一股或双股，改变DNA分子拓扑构象，避免DNA分子打结、缠绕、连环，在复制的全程中都起作用。

类型：拓扑异构酶I和拓扑异构酶II。拓扑异构酶I：能切断DNA双链中一股并再连接断端，反应不需ATP供能；拓扑异构酶II：能使DNA双链同时发生断裂和再连接，需ATP供能。第十章-DNA生物合成-复制108

局部解链后第十章-DNA生物合成-复制

解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。第十章-DNA生物合成-复制（三）DNA单链结合蛋白（singlechainbindingprotein-SSB）

可以维持模板的单链状态并保护模板不受核酸酶的降解。随着DNA双链的不断解开，SSB能不断的与之结合、解离。第十章-DNA生物合成-复制第十章-DNA生物合成-复制（四）引物酶（primase）是一种RNA聚合酶，在复制的起始点处以DNA为模板，催化合成一小段互补的RNA。引物酶能直接在单链DNA模板上催化游离的NTP合成一小段RNA，并由这一小段RNA引物提供3’-OH，经DNA聚合酶催化链的延伸。

第十章-DNA生物合成-复制（五）DNA聚合酶

全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)

简称：DNA-pol

活性：

5

3

的聚合活性

5

3

核酸外切酶活性

35核酸外切酶活性第十章-DNA生物合成-复制5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´3

5

外切酶活性5

3

外切酶活性?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。第十章-DNA生物合成-复制1、原核生物的DNA聚合酶催化DNA聚合参与DNA损伤的应急状态修复修复合成、切除引物、填补空隙功能2040400分子数/细胞1011亚基数+-+5

外切酶活性+++

5

外切酶活性+++5

聚合酶活性polIIIpolIIpolI第十章-DNA生物合成-复制功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）第十章-DNA生物合成-复制323个氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

第十章-DNA生物合成-复制DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。

第十章-DNA生物合成-复制功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)第十章-DNA生物合成-复制

2、真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

起始引发，有引物酶活性DNA-pol

参与低保真度的复制DNA-pol

在线粒体DNA复制中起催化作用DNA-pol

延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol

校读、修复和填补缺口第十章-DNA生物合成-复制（六）DNA连接酶（DNAligase）

连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。第十章-DNA生物合成-复制HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’第十章-DNA生物合成-复制酶-AMP-P-DNA酶-AMPEnzyme-第十章-DNA生物合成-复制三、DNA复制的保真性（一）酶学依据：

1.核酸外切酶活性和校读；

2.复制的保真性和碱基选择。（二）机制：

1.遵守严格的碱基配对规律；

2.聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；

3.复制出错时有即时的校读功能。第十章-DNA生物合成-复制DNA生物合成过程第三节第十章-DNA生物合成-复制一、原核生物DNA生物合成（一）起始阶段

1.辨认起始点，形成单链

2.合成引发体

3.合成引物

第十章-DNA生物合成-复制E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列5

3

5

3

3个13bp串联重复序列：AT丰富，易解链4个9bp（2组）反向重复序列第十章-DNA生物合成-复制复制子第十章-DNA生物合成-复制DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

第十章-DNA生物合成-复制第十章-DNA生物合成-复制3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶第十章-DNA生物合成-复制（二）延长阶段复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。催化此反应的酶：原核生物：DNA-polⅢ真核生物：DNA-polα—催化不连续复制

DNA-polδ—催化连续复制

第十章-DNA生物合成-复制领头链的合成第十章-DNA生物合成-复制随从链的合成第十章-DNA生物合成-复制目录第十章-DNA生物合成-复制复制过程简图目录第十章-DNA生物合成-复制冈崎片段随从链不连续复制的片段称为冈崎片段，其大小在1000－－2000个核苷酸。每一个不连续复制的片段5’-端都带有一个RNA引物。片段的复制完成后，RNA引物会被除去而代之以DNA片段，因此复制至最后，两股子链都是DNA链。第十章-DNA生物合成-复制3

5

3

5

解链方向3’5’3’3’5’冈崎片段第十章-DNA生物合成-复制复制叉引导的复制方向亲代DNA双链前导链

随从链冈崎片段RNA引物第十章-DNA生物合成-复制5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接第十章-DNA生物合成-复制复制过程动画第十章-DNA生物合成-复制滚环复制（rollingcirclereplication）：简单低等生物的复制方式。第十章-DNA生物合成-复制+-+-+-+-5'5'3'3'3'3'+-5'3'3'+-5'3'3'3'5'5'+-5'3'3'5'+-+-+切断外环外环5'结合特殊蛋白，5'以内环为模板复制外环不断剥离内环外环的互补链间断合成核酸酶切第十章-DNA生物合成-复制线粒体DNA复制：D-环形。第十章-DNA生物合成-复制（三）终止阶段

原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500第十章-DNA生物合成-复制oriC82ter32第十章-DNA生物合成-复制二、真核生物DNA生物合成（一）DNA的复制只发生在S期（二）多复制子（三）真核细胞含有5种DNA聚合酶（四）端粒复制染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。第十章-DNA生物合成-复制•

真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。•

复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。•

增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制的起始第十章-DNA生物合成-复制哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM第十章-DNA生物合成-复制3

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA随从链引物核小体（二）复制的延长第十章-DNA生物合成-复制第十章-DNA生物合成-复制（三）复制的终止染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。第十章-DNA生物合成-复制5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

第十章-DNA生物合成-复制

1、端粒（telemer）：指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。

2、结构特点：（1）由末端单链DNA序列和蛋白质构成。（2）末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。第十章-DNA生物合成-复制

3、功能：（1）维持染色体的稳定性（2）维持DNA复制的完整性

4、端粒酶：由RNA和蛋白质组成（1）RNA发挥模板作用（2）蛋白质发挥逆转录酶活性第十章-DNA生物合成-复制端粒酶(telomerase)的组成端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

第十章-DNA生物合成-复制端粒酶：为RNA-蛋白质复合物端粒酶RNA与端粒DNA(telomereDNAsequenceTEL)互补。人端粒酶RNA（hTR）模板序列为5'CUAACCCUAA-3'。端粒酶是一种特殊的反转录酶。以端粒酶RNA为模板催化端粒DNA重复序列延长。第十章-DNA生物合成-复制胚胎组织有活性；正常体细胞中除睾丸、卵巢、造血干细胞外均无端粒酶活性。细胞老化端粒缩短，甚至消失。某些恶性肿瘤可见端粒缩短、端粒酶激活。端粒DNA重复序列与端粒酶对基因组起双重保护作用。第十章-DNA生物合成-复制端粒酶的催化延长作用爬行模型第十章-DNA生物合成-复制DNA聚合酶复制子链进一步加工第十章-DNA生物合成-复制端粒酶的爬行模型（动画演示）第十章-DNA生物合成-复制4、端粒和端粒酶的生物学意义端粒特别是端粒酶的活性与细胞的生长、繁殖、衰老凋亡以及肿瘤的发生密切相关。端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而逐渐变短至消失，可导致染色体稳定性下降，导致细胞衰老凋亡。体细胞几乎没有端粒酶活性，随多次细胞分裂端粒逐渐缩短，细胞失去增殖能力。而端粒酶活性较高的胚原细胞，端粒长度未缩短。肿瘤细胞端粒酶重新获得活性，以维持端粒结构致使染色体稳定而成为永生细胞。肿瘤细胞的端粒比正常人同类细胞显著缩短。第十章-DNA生物合成-复制逆转录(reversetranscription)

第四节第十章-DNA生物合成-复制一、概念

逆转录指遗传信息从RNA流向DNA，是RNA指导下的DNA合成过程，即以RNA为模板，四种dNTP为原料，合成与RNA互补的DNA单链。RNADNA

逆转录酶第十章-DNA生物合成-复制二、逆转录酶(reversetranscriptase)

催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA病毒中都含有此酶。具有三种酶活性：

RNA指导的DNA聚合酶活性

RNA酶活性

DNA指导的DNA聚合酶活性第十章-DNA生物合成-复制①RNA指导的DNA聚合酶活性：以RNA为模板以四种dNTP为原料催化互补DNA的合成。需Zn2+；引物为tRNA；合成反应的方向为5'→3'。②RNA酶活性：水解DNA-RNA中的RNA；③DNA指导的DNA聚合酶活性：以DNA第一链为模板，dNTP为原料，催化互补的DNA第二链合成。第十章-DNA生物合成-复制三、合成过程

RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA第十章-DNA生物合成-复制病毒RNA经反转录形成的双链DNA，在宿主细胞内有如下作用：①可通过基因重组作用插入到宿主基因组中，并随宿主细胞复制表达。这种在活细胞内的基因重组又称为整合（integration）。这可打乱宿主细胞遗传信息的正常秩序，甚至由此导致细胞恶性变；②以DNA为模板，转录生成大量病毒RNA；③以DNA为模板，转录生成病毒mRNA，进一步翻译生成若干种病毒蛋白，用以包装病毒，使之成为有感染力的病毒颗粒，扩大感染。第十章-DNA生物合成-复制逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNAcDNAcomplementaryDNA第十章-DNA生物合成-复制逆转录发现的意义：对传统的生物学中心法则提出挑战。RNA同样兼有遗传信息携带和表达功能。RNA在进化过程中可能比DNA出现更早。为进一步研究病毒致癌机理、肿瘤病因等树立了一个新的里程碑。为探索肿瘤、爱滋病等病因，在设计治疗策略上均起到了重要的推动作用。反转录酶已成为重要的工具酶之一，具有重要的应用价值（如构建cDNA文库、筛选目的基因、应用反转录PCR扩增目的基因等）。第十章-DNA生物合成-复制DNA损伤与修复第五节第十章-DNA生物合成-复制DNA的变异（variation）：是指DNA分子中一个或多个碱基的结构或功能的异常变化。有的可称突变（mutation）。对机体有害的变异称DNA的损伤（DNAdamage）。有益的变异是进化、分化的分子基础。第十章-DNA生物合成-复制一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础第十章-DNA生物合成-复制二、引发突变的因素（一）物理因素：紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射

UV第十章-DNA生物合成-复制（二）化学因素：第十章-DNA生物合成-复制三、突变的分子改变类型（一）错配(mismatch)DNA分子上的碱基错配称点突变(pointmutation)。

1.转换：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

2.颠换：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。第十章-DNA生物合成-复制镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽链CTCGAG基因第十章-DNA生物合成-复制（二）缺失(deletion)、插入(insertion)1.缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。

2.插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。

3.缺失或插入都可导致框移(frame-shift)突变。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。

第十章-DNA生物合成-复制谷酪蛋丝5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬组缬正常5’……