实验细胞化学染色POX省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

细胞化学染色沧州医专医学技术系侯振江1/73细胞化学染色，是一个以形态为基础，结合利用化学或生物化学技术对血细胞内各种化学成份作定位、定性及半定量分析方法。用于研究血细胞生理、病理和化学结构；临床上为一些血液病诊疗、判别诊疗、疗效观察、预后监测和发病机制探讨，提供主要依据。2/73血细胞化学染色基本要求是在原位显示细胞成份和结构，反应产物应是有色沉淀物，含有一定稳定性。血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。3/73（一）固定固定有物理法与化学法，物理法为干燥和火焰固定，化学法最惯用是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。血细胞化学染色流程4/73（二）显示

1、偶氮偶联法：利用人工合成酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引发偶氮偶联，使其形成不溶性偶氮色素，以此证实酶存在。

2、联苯胺法：粒细胞和单核细胞中过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色联苯胺形成蓝色沉淀。5/733、普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。4、雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。5、金属从容法其它还有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦惯用于临床血液细胞学诊疗。6/73（三）细胞化学定量粗略估量，以染色反应强弱，受色深浅，人为地域别为阴性和各种程度阳性。百分法，只能反应细胞阳性率，不能反应受色强弱。积分法，是惯用半定量法，将等级估量与百分率相结合它既反应了细胞阳性率高低，又反应了细胞受色强弱。7/73下面介绍几个惯用细胞化学染色方法这些方法学在白血病判别诊疗上含有主要意义。8/73一、过氧化物酶染色（POX）（一）四甲基联苯胺法(TMB)【原理】

粒细胞和单核细胞胞浆内髓过氧化物酶（POXorMPO）分解过氧化氢，释放新生态氧，使无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺，后者深入变成棕色化合物从容于细胞质内。9/73POX

新生态氧

[O]↑过氧化氢（基质中）四甲基联苯胺TMB（无色）联苯胺蓝（蓝色）亚硝基铁氰化钠

蓝色颗粒（浆内酶部位）粒、单核细胞胞浆【原理】四甲基苯醌二胺(棕色)自我脱氢氧化10/73【试剂】1%TMB亚硝基铁氰化钠饱和溶液1%过氧化氢溶液稀过氧化氢溶液瑞氏染色液11/73

【操作】1.取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μl，混合溶液呈淡棕黄色。2.在新鲜干燥血片上，加混合溶液0.5ml,

放置lmin后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml，染色6min。3.瑞氏染液复染15～20min。4.油镜镜检。12/73

【结果】细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。（－）无颗粒从容；（±）颗粒细小，分布稀疏；（+）颗粒较粗，局灶分布；（++）颗粒粗大，分布较密，占胞质1/2~2/3；（+++）颗粒粗大，呈团块分布；（++++）全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核。13/7314/73骨髓片POX染色15/73【临床意义】（1）粒系：POX主要分布在粒细胞和单核细胞内，伴随粒细胞成熟程度而逐步增强，中性分叶核粒细胞为强阳性。嗜酸性粒细胞阳性程度最强，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。碱性粒细胞为阴性。16/73（2）单核细胞：

原始单核细胞为阴性反应，

幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应，颗粒细小，弥散分布。17/73（3）其它细胞淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细胞、巨核细胞均呈阴性反应。（4）血小板过氧化物酶主要定位于幼稚型巨核细胞核膜上，可作为原巨核细胞一个标志物，有利于FABM7识别。18/73（5）过氧化物酶染色主要用于判别急性白血病类型，急性髓细胞白血病多呈阳性反应，以M3和M2型反应最强，MI和M5型反应较弱，故有利于区分M3和M5型。急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应，故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病判别主要指标。19/73

注意事项

涂片应新鲜制作、厚薄适宜。TMB配制在85％～88％乙醇溶液中染色效果很好，勿用90％～95％乙醇，不然细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗透而使显色反应减弱或消失。过氧化氢溶液需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示过氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效。染色液适宜pH值应为5.5，若pH值<5.0会出现假阳性结果。试剂应置于低温暗处，预防光线照射失效。染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀，不然同一片子上细胞染色情况不一致。20/73AML-M121/7322/73M1-POX(+)23/73×24/73二、苏丹黑B染色【原理】苏丹黑B(sudanblackB,SB)是一个能溶解于脂肪中色素染料，可使细胞内中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即使细胞内微细结构脂类物质也能显示出来。25/73【试剂】1.10%甲醛液。2.苏丹黑B乙醇溶液26/73【操作】1．干燥血片或骨髓片在甲醛蒸气中固定。2．自来水冲洗。3．放人染色液中，37℃染色30~60min。4．用70%乙醇脱色1~2min，水洗lmin。.5．瑞氏染液复染20~30min。27/73

【结果】脂类呈黑色或棕黑色颗粒，定位于细胞浆中（+）颗粒很小，细小、稀疏，或胞质局部面积1/4有致密颗粒。（++）颗粒较少，或胞质面积1/2出现黑色颗粒。（+++）颗粒较密，或胞质面积3/4出现黑色颗粒。（++++）颗粒极密，颗粒间无间隙。28/73【临床意义】1.粒细胞系早幼粒及以下阶段伴随细胞成熟，阳性颗粒逐步增加。早期原粒细胞普通为阴性，少数细小点状颗粒代表线粒体被染色晚期原粒细胞可出现阳性颗粒，其颗粒限于胞浆某一区域。29/732.单核细胞系阳性，颗粒细小，分布弥散，形状不规则。原单核细胞为阴性。3．红细胞系、淋巴细胞系均呈阴性反应4．尼曼一匹克细胞和戈谢细胞均为阳性反应。30/735．苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相同，主要用于急性白血病类型判别。苏丹黑B染色较过氧化物酶染色更敏感，但特异性不如过氧化物酶染色（极少数急性淋巴细胞白血病可为阳性）。31/73M1-SBB(+)32/73M2-SBB(+)33/73三、过碘酸一雪夫（PAS)染色【原理】

胞浆内存在糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（periodicacid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫(Schiff)试剂中无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于胞浆中。该反应称为过碘酸一雪夫(PAS)阳性反应。34/73【结果】（1）粒细胞系：原粒细胞多呈阴性反应，也可弱阳性。自早幼粒细胞以后伴随细胞成熟程度，阳性反应逐步增强。嗜酸粒细胞颗粒本身不着色，但颗粒间胞质呈弥漫性阳性反应；嗜碱粒细胞为阳性反应，颗粒紫红色，大小不一。35/73

中性粒细胞糖原含量参考标准（-）胞质无颗粒（+）胞质呈淡红色，无颗粒（++）胞质呈红色，有少许颗粒（+++）胞质呈暗红色，颗粒较密（++++）胞质呈紫红色，颗粒极密36/73过碘酸-Schiff反应(PAS)37/73（2）淋巴细胞系：

大多数淋巴细胞呈阴性反应，

少数为（+）阳性反应。淋巴细胞糖原含量程度参考标准（-）胞质内无颗粒（+）胞质内有颗粒（++）有较粗红色颗粒（+++）有粗大红色颗粒（++++）颗粒粗大并有红色块状38/73

（3）红细胞系：

幼红细胞和红细胞呈阴性反应红细胞系列糖原含量程度参考标准（-）胞质无颗粒（+）有少数红色颗粒（++）有较粗红色颗粒或弥漫红色（+++）有粗大红色颗粒或深红色（++++）有粗大红色块状或紫红色39/73（4）巨核细胞：

巨核细胞和血小板染色反应均为阳性巨核细胞糖原含量程度参考标准（-）胞质无颗粒（+）少许糖原包涵体（++）中等量糖原包涵体，定位于核膜出或分散胞质中，占胞质1/3

（+++）大量糖原包涵体分散于胞质1/2

（++++）糖原包涵体充满整个胞质40/73PAS巨核细胞巨核细胞包涵体41/73

（5）单核细胞呈阴性或阳性，颗粒细小，往往位于胞质边缘；

浆细胞大多呈阴性，少数为红色颗粒阳性；

组织细胞为阴性反应；巨噬细胞可呈阳性，为红色颗粒反应。42/73

【临床意义】（1）M6与巨幼贫判别

M6幼红细胞PAS可呈强阳性，积分显著增高，巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴性。（2）急性白血病类型判别

ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性，AML为阴性，急性单核细胞白血病时原单核细胞及幼单核细胞PAS阳性，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。43/73ALL-L144/73L1PAS(+)45/73AML-M546/73M5PAS(+)47/73AML-M648/73AML-M6PAS(+)49/73AML-M750/73M7PAS(+)51/73（3）巨核细胞和Sternberg细胞判别

巨核细胞PAS强阳性，Sternberg细胞为阴性或弱阳性。（4）戈谢氏细胞强阳性，尼曼-皮克细胞阴性或弱阳性。（5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞糖原积分增高；普通病毒感染，糖原积分在正常范围内。52/73四、中性粒细胞碱性磷酸酶染色偶氮偶联法（Kaplow法）【原理】中性粒细胞胞浆中碱性磷酸酶在pH9.2~9.8缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出磷酸与萘酚。再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。53/73【结果】坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒，坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。“一”阴性反应，胞浆中无阳性染色颗粒。“＋”胞浆中含有少许颗粒或呈弥散浅红色（或弥散紫色）。

“2＋”胞浆中含有中等量颗粒或弥散受色。“3＋”胞浆中有丰富颗粒或弥散深色，胞核清楚。“4＋”有极丰富粗大颗粒，充满胞浆，或弥散深色，胞核不清楚。54/73中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)偶氮偶联法55/73

NAP积分法

计数100个成熟中性粒细胞，按其反应强度分级，各级百分率与其级数乘积总和，即为积分。例如：NAP反应结果（%）（-）（+）（++）（+++）（++++）

204020155

积分=（0×20）+（2×20）+（3×15）+（4×5）=145

参考值：正常人血细胞碱性磷酸酶除成熟中性粒细胞（杆状核及分叶核）可见阳性外，其它血细胞均为阴性。中性粒细胞NAP活性积分值普通为10～50分，但有时可高达162分。

56/73

【临床意义】（1）生理改变：

新生儿NAP增高，成人较儿童减低，老人更低；激烈运动增高；

月经期经前增高，行经后降低，经后期恢复正常；

妊娠期2-3月轻度增高，以后逐步增高，分娩时到达高峰，产后恢复正常。57/73（2）、病理改变

增高：严重化脓性感染、类白血病反应、AA、CML加速期、ALL、CLL、恶性淋巴瘤、癌转移、MM、真红、骨髓纤维化等。

减低：PNH、CML、恶性组织细胞病、MDS。58/73

（3）疾病判别诊疗慢粒与类白判别：CML减低，类白增高。急性白血病判别：AML减低，ALL增高。

PNH与AA判别：PNH减低，AA增高。病原微生物判别：病毒感染减低，细菌感染增高。59/7360/73NAP(++++)CML-NAP(-)61/73五、骨髓铁染色

【原理】正常人骨髓中贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中，骨髓中铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝反应，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁部位，从而反应骨髓中铁储存量。化学反应过程为：

4Fe3+＋3K4［Fe（CN）6］→Fe4〔Fe（CN）6〕3＋12K+（含铁物质）

（亚铁氰化钾）

（亚铁氰化铁）

62/73【结果】

（1）细胞外铁观察：

细胞外铁呈蓝色颗粒状、小株状或团块状。以油镜观察定级标准（-）无铁粒可见。（+）少数铁粒或铁小珠。（++）较多铁粒和铁小珠。（+++）很多铁粒、铁小珠和少数小块。（++++）极多铁粒、铁小珠并有很多小块，密集成堆。正常范围：+～++，“+”占2/3，“++”占1/3。63/73细胞外铁64/73（2）细胞内铁观察：

细胞内铁指有核红细胞胞质内出现蓝色颗粒，以油镜计100个中、晚幼红细胞，统计胞质中含有蓝色小颗